溶菌酶基因转化籼稻及抗稻瘟病杂交组合选育的研究

论文摘要

稻瘟病严重威胁着水稻生产,溶菌酶能够分解细菌或真菌细胞壁组分中多糖的糖苷键,从而抵御病原菌的侵染。因此利用溶菌酶基因转化籼稻,培育广谱高抗稻瘟病新种质,是水稻抗病育种的有效途径。本文以溶菌酶基因为目的基因,对农杆菌介导法和穗颈注射法转化超级杂交稻亲本不育系PA64s,恢复系R640、9311、MH63进行了系列研究,并对其转基因植株后代进行了遗传稳定性分析和抗性鉴定,将筛选出的优良抗病株系与其他亲本进行了杂交配组。主要研究结果概括如下:1优化了籼稻离体再生体系培养基以MS、NB和CC基本培养基中大量元素、微量元素Ⅰ（锰、锌、硼）、微量元素Ⅱ（铜、钼、钴、碘）、有机成分四种组分设计L9（34）正交试验,优选出了四个籼稻材料愈伤组织诱导、继代及分化最优的组分,获得了不同阶段的最佳培养基。研究结果表明,NB培养基中微量元素Ⅰ、NB或MS培养基中的有机成分有助于愈伤诱导,单独使用2,4-D愈伤诱导率高于不同浓度2,4-D和BA配合使用或BA单独使用;MS有机成分和大量元素、NB微量元素Ⅰ有助于愈伤增殖;NB大量元素和微量元素Ⅰ、10×CC微量元素Ⅱ有助于愈伤分化。采用优选培养基培养PA64s、9311、R640、MH63四个籼稻材料,平均愈伤诱导率为86.6%,继代25 d平均增殖倍数为3.85,平均分化率为88.1%。2优化了籼稻愈伤组织农杆菌转化方法对根癌农杆菌EHA105转化籼稻愈伤组织的技术体系进行了优化,其优化后的程序为:在农杆菌侵染液中添加终浓度为120μM的乙酰丁香酮,侵染液浓度为OD600为0.4～0.6,侵染愈伤组织时间控制在20～30 min,-0.8MPa负压处理10 min,共培养时在共培养培养基表面覆盖一层滤纸,共培养3 d,侵染后的愈伤组织在抑菌培养基中恢复生长2周,先用150 mg/L的G418进行筛选,再用165 mg/L G418进行筛选。转化方法优化后G418筛选结果为:4个籼稻材料的平均抗性愈伤率为17.77%,平均抗性植株率为3.94%。3优化了穗茎注射法研究结果表明,穗颈节下第一节间部位注射,注射时期为主穗叶枕距7 cm以上,质粒浓度为500μg/ml,质粒DNA使用TE缓冲液溶解,R640、9311、MH63三个受体材料转化率皆达到7%以上,且三个品种的转化率差异不显著,说明优化的转化方法适合于不同的品种。进一步用携带了溶菌酶基因的工程农杆菌菌液进行穗茎注射,得到9株阳性株,转化率为0.03%。PCR检测初步确定目的基因与标记基因同时整合到基因组,Southern检测及后代分离比例证实为单拷贝整合。该方法以种质系统为受体,其整合方式可能是农杆菌整合方式,结合了农杆菌介导法和穗茎注射法的优势,是值得探索的一条转化途径。4获得了抗稻瘟病的转基因植株通过农杆菌介导法获得转化植株55株,通过质粒DNA穗茎注射法获得转化植株98株,通过农杆菌菌液穗茎注射法获得转化植株9株,经PCR和Southern杂交检测,证实了外源溶菌酶基因的整合。转化植株后代分离比的追踪分析结果表明,农杆菌介导法和农杆菌菌液穗茎注射法获得的转基因植株全为单拷贝整合,T1、T2代分离比基本符合孟德尔遗传规律。质粒DNA穗茎注射法获得的转化植株部分为单拷贝整合,部分植株为多拷贝整合。经过对转化植株T1、T2代的稻瘟病抗病性鉴定、PCR检测及纯合度检测,最终从2代中鉴定出21株“中抗”的阳性纯合转基因单株。5获得了抗稻瘟病的新杂交组合将筛选出的21个中抗纯合转基因株系作为亲本进行杂交配组,得到33个组合。抗性鉴定结果表明,与对照组合（抗性级别为“感”）相比,33个组合稻瘟病抗性皆有明显提高,3个组合表现为“抗”,26个组合表现为“中抗”,4个组合表现为“中感”;农艺性状考察结果表明,与对照组合相比,33个组合中22个组合农艺性状无显著差异,11个组合单株产量下降。综合抗性鉴定与农艺性状考察,获得了18个在生产上有应用前景的抗稻瘟病的新杂交组合,新杂交组合的进一步研究正在进行中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 水稻抗稻瘟病分子育种研究进展
• 1.1 稻瘟病抗性基因定位与克隆
• 1.2 稻瘟病抗性基因聚合育种
• 1.3 转基因抗稻瘟病育种
• 1.4 抗稻瘟病分子育种展望
• 2 根癌农杆菌介导法转化水稻的研究进展
• 2.1 农杆菌转化受体系统的研究进展
• 2.2 农杆菌转化侵染体系的研究进展
• 2.3 农杆菌介导转化水稻展望
• 3 外源总DNA导入分子育种研究进展
• 3.1 外源总DNA导入分子育种的意义
• 3.2 外源总DNA导入分子育种的理论基础
• 3.3 外源总DNA导入分子育种工作的成就
• 3.4 外源总DNA导入分子育种展望
• 4 本研究目的与意义
• 5 本研究的主要内容
• 第二章 农杆菌介导溶菌酶基因转化籼稻的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 质粒与农杆菌菌株
• 1.1.3 引物
• 1.1.4 培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 外植体的培养
• 1.2.2 工程菌的制备
• 1.2.3 G418筛选愈伤组织临界浓度的确定
• 1.2.4 农杆菌对愈伤组织的转化
• 1.2.5 转化子的筛选与再生培养
• 1.3 转化植株的分子检测
• 1.3.1 植物总DNA的提取
• 1.3.2 拟转化株的PCR检测
• 1.3.3 拟转化植株的Southern检测
• 2 结果与分析
• 2.1 转化受体系统的优化
• 2.1.1 基本培养基对愈伤组织诱导的影响
• 2.1.2 不同激素浓度及配比对愈伤组织诱导的影响
• 2.1.3 基本培养基对愈伤组织继代培养的影响
• 2.1.4 基本培养基对愈伤组织分化的影响
• 2.1.5 籼稻成熟胚离体再生体系优化结果
• 2.2 G418筛选愈伤组织临界浓度确定
• 2.3 农杆菌转化侵染体系的研究
• 2.3.1 农杆菌菌液浓度对转化的影响
• 2.3.2 乙酰丁香酮（AS）对农杆菌转化的影响
• 2.3.3 侵染时间对农杆菌转化的影响
• 2.3.4 负压处理对农杆菌转化的影响
• 2.3.5 共培养对农杆菌转化的影响
• 2.3.6 筛选方式对农杆菌转化的影响
• 2.4 农杆菌转化籼稻成熟胚愈伤组织技术流程
• 2.5 农杆菌转化结果
• 2.6 转化植株的分子检测
• 2.6.1 转化植株的PCR检测
• 2.6.2 转化植株的Southern检测
• 3 讨论
• 3.1 影响籼稻胚性愈伤组织形成的因素
• 3.2 影响农杆菌介导转化水稻的因素
• 3.2.1 Vir基因活化物的添加
• 3.2.2 负压处理
• 3.2.3 共培养方式
• 3.2.4 筛选培养
• 第三章 穗茎注射法导入溶菌酶基因的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 基因
• 1.1.2 受体材料
• 1.1.3 试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 质粒DNA注射液的制备
• 1.2.2 工程农杆菌菌液注射液的制备
• 1.2.3 穗茎注射方法
• 1.2.4 G418筛选种子临界浓度的确定
• 1.2.5 G418筛选T0代种子
• 1.2.6 注射处理植株结实率统计
• 1.2.7 转化植株的PCR检测
• 1.2.8 转化植株Southern检测
• 2 结果与分析
• 2.1 G418筛选种子临界浓度的确定
• 2.2 注射处理对结实率的影响
• 2.3 质粒DNA穗茎注射方法的研究
• 2.3.1 注射时期对转化率的影响
• 2.3.2 质粒DNA浓度对转化率的影响
• 2.3.3 质粒DNA不同溶液稀释对转化率的影响
• 2.3.4 不同籼稻品种对转化率的影响
• 2.3.5 注射处理材料G418筛选、PCR检测结果
• 2.4 工程农杆菌菌液穗茎注射的研究
• 2.4.1 菌液穗茎注射T0代G418筛选结果
• 2.4.2 菌液穗茎注射T0代NPTⅡ基因PeR检测结果
• 2.4.3 菌液穗茎注射T0代溶菌酶基因PCR检测结果
• 2.5 Southern检测结果
• 3 讨论
• 3.1 质粒DNA穗茎注射法导入外源DNA的机理
• 3.2 穗茎注射法对受体植株结实率的影响
• 3.3 注射时期是穗茎注射转化成功的关键因素
• 3.4 外源DNA降解对穗茎注射转化的影响
• 3.5 质粒DNA穗茎注射转基因植株的拷贝数
• 3.6 提高工程农杆菌菌液穗茎注射转化率的途径
• 3.7 三种转化方法的比较
• 第四章 转基因植株后代遗传稳定性分析、抗性鉴定及杂交组合选育的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 遗传分析
• 1.2.2 纯合单株检测
• 1.2.3 穗颈瘟鉴定
• 1.2.4 农艺性状分析
• 2 结果与分析
• 2.1 T1代PCR检测结果
• 2.2 T2代PCR检测结果
• 2.3 T1代抗病鉴定
• 2.4 T2代株系的抗病鉴定
• 2.5 杂交组合的抗病性鉴定
• 2.6 杂交组合的农艺性状考察
• 3 讨论
• 3.1 溶菌酶基因稻瘟病抗性探讨
• 3.2 外源基因遗传稳定性
• 3.3 转基因材料在育种中的应用
• 3.4 目标性状在杂交后代中的遗传
• 3.5 目的基因对非目标性状的影响
• 总结
• 1.全文结论
• 1.1 高频离体再生体系的建立
• 1.2 农杆菌转化体系的优化
• 1.3 穗茎注射法的探索
• 1.4 抗稻瘟病转基因株系的获得
• 1.5 抗稻瘟病的新杂交组合的获得
• 2.本文创新性
• 3.展望
• 参考文献
• 附录 图版
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间科研学术成果目录