NADH再生系统和乙醇突变株的构建及其生产1，3-丙二醇初步研究

论文摘要

还原力NADH是微生物产生1,3-丙二醇途径必需的物质。微生物在生成1,3-丙二醇的途径中伴随着很多副产物,如乙醇、乳酸、琥珀酸、2,3-丁二醇（2,3-BD）等,这些副产物的生成与1,3-丙二醇产生途径竞争NADH。本工作一方面在野生型K. oxytoca M5al中引入NADH再生系统,另一方面将K. oxytoca M5al中产生乙醇的途径阻断掉,以使更多的NADH流向1,3-丙二醇产生途径。在M5al中构建了NADH再生系统（pDK7-fdh）,为了重组质粒pDK7-fdh能够在细胞繁殖过程中稳定遗传,在重组质粒pDK7-fdh中引入了质粒平均分配基因parDE得到重组菌株F6。F6在传代160代后质粒仅丢失3 %,甲酸脱氢酶（FDH）酶活与传代前相比只降低了1.77 %;而不含parDE的重组菌FY和F-1传代160代后质粒分别丢失了78 %和93 %,FDH比酶活分别降低了25 %和49 %。上罐检测甲酸脱氢酶酶活表明F6最高比酶活为26.32 U/mg,是M5al最高比酶活10.79 U/mg的2.43倍。F6摇瓶实验表明,加入甲酸脱氢酶的底物甲酸钠后,1,3-丙二醇的生产强度明显加强,发酵47 h达到0.3 g.l-1h-1,而没有加入甲酸钠的F6只有0.19 g.l-1h-1;且添加甲酸钠后副产物乙酸提高了7.2倍,乙醇产量提高了1.2倍。另外,F6和M5al发酵58 h的1,3-丙二醇产量并没有明显提高,分别是13.75 g/l和13.16 g/l,但是乙醇和乙酸的产量分别提高了24 %和30 %,且F6的生长加快。另外,利用自杀载体pGPCm和pGPKm成功构建了aldH缺失突变株（MH）和adhE缺失突变株（ME）。比酶活测定结果显示,MH的ADH与M5al相差不大,分别为11.44 U/mg和11.86 U/mg,而ALDH比酶活为0.796 U/mg,是M5al的22 %;ME的ADH比酶活只有4.74 U/mg,是M5al的40 %,ALDH比酶活是0.934 U/mg,为M5al的26 %。在有氧和厌氧条件下,ME都几乎没有乙醇产生,而M5al乙醇最高产量分别为3.29 g/l和1.1 g/l。摇瓶发酵表明,在阻断了菌体的乙醇生成途径后,ME的生长速率明显降低,由此造成甘油消耗率降低,1,3-丙二醇的生成速率也随之降低。但是另一种化工和食品中十分有用的产物——2,3-丁二醇的生成却明显升高,发酵48 h 2,3-丁二醇的产量是10.23 g/l,比M5al提高了51 %;延长发酵时间至72 h后1,3-丙二醇的产量最高为15.89 g/l,2,3-丁二醇最高产量却达到了13.81 g/l,M5al 1,3-丙二醇最高是17.38 g/l,2,3-丁二醇只有6.58 g/l,即ME 2,3-丁二醇的产量比对照提高了约1.1倍。与M5al相比,MH的乙醇产量并没有明显降低,1,3-丙二醇产量也无明显变化,而乙酸的产量却升高了。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第1章 文献综述
• 1.1 1,3-丙二醇的性质
• 1.2 化学法生产1,3-丙二醇
• 1.2.1 环氧乙烷羰基化法
• 1.2.2 丙烯醛水合法
• 1.2.3 其它合成方法
• 1.3 微生物法生产1,3-丙二醇
• 1.4 甘油歧化1,3-丙二醇的代谢过程
• 1.4.1 甘油歧化过程中的关键酶
• 1.4.2 甘油歧化途径的改造
• 1.5 利用基因工程菌生产1,3-丙二醇
• 1.5.1 dha 调节子
• 1.5.2 基因工程菌的构建策略
• 1.6 微氧发酵
• 1.7 辅酶NADH 再生研究进展
• 1.7.1 辅酶的电化学法再生
• 1.7.2 辅酶的酶法再生
• 1.8 1,3-丙二醇的提取和纯化
• 1.9 论文研究的目的和意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 菌种、质粒及引物
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 酶和试剂盒
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计和PCR 扩增
• 2.2.2 DNA 产物的回收
• 2.2.3 连接与转化
• 2.2.4 质粒的提取
• 2.2.5 DNA 酶切
• 2.2.6 DNA 测序
• 2.2.7 两亲本杂交—接合
• 2.2.8 菌体培养液浊度及菌体浓度的测定
• 2.2.9 发酵液甘油、1,3-丙二醇和副产物的测定方法-HPLC 法
• 2.2.10 重组菌甲酸脱氢酶活力测定
• 2.2.11 质粒稳定性的测定方法
• 2.2.12 蛋白质的测定方法
• 2.2.13 热击用大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.14 蛋白质的SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.15 乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性的测定
• 第3章 NADH 再生系统的构建及PARDE 对其稳定性的影响
• 引言
• 3.1 NADH 再生系统在K.OXYTOCA M5AL 中的构建
• 3.1.1 PCR 引物设计
• 3.1.2 甲酸脱氢酶基因的获取
• 3.1.3 中间载体pMD18-T Simple-fdh 的构建和鉴定
• 3.1.4 NADH 再生系统在K.oxytoca 中的构建和鉴定
• 3.2 质粒平均分配基因 PARDE 对NADH 再生系统稳定性影响
• 3.2.1 重组质粒的构建
• 3.2.2 不同重组质粒在产酸克氏杆菌中的稳定性
• 3.2.3 重组菌株传代后fdh 基因的表达
• 3.2.4 重组菌株传代后甲酸脱氢酶活性的变化
• 3.3 小结
• 第4章 NADH 再生系统对1,3-丙二醇合成的影响
• 引言
• 4.1 甲酸脱氢酶在重组菌F6 中表达及酶活的测定
• 4.2 甲酸钠的添加对1,3-丙二醇合成的影响
• 4.2.1 添加与不添加甲酸钠对1,3-丙二醇合成的影响
• 4.2.2 添加pH 5.2 和pH 7.0 甲酸钠溶液对1,3-丙二醇合成的影响
• 4.2.3 不同时间添加甲酸钠对对1,3-丙二醇合成的影响
• 4.3 NADH 再生系统对1,3-丙二醇合成的影响
• 4.4 小结
• 第5章 乙醇途径敲除突变株的构建及鉴定
• 引言
• 5.1 构建ADHE 和ALDH 基因敲除菌的思路
• 5.1.1 与辅酶NADH 相关的K.oxytoca 代谢网络分析
• 5.1.2 K. oxytoca 中乙醇合成途径分析
• 5.2 自杀载体与染色体同源双交换原理
• 5.3 ADHE 基因和ALDH 上下两臂基因的扩增
• 5.3.1 adhE 基因的扩增
• 5.3.2 aldH 上下两臂基因的扩增
• 5.4 PCR 产物的克隆及测序
• 5.5 自杀载体的构建
• 5.5.1 自杀载体pKEG 的构建
• 5.5.2 自杀载体pCHG 的构建
• 5.6 突变株的筛选
• 5.7 突变株的鉴定
• 5.8 小结
• 第6章 突变株生成乙醇和1,3-丙二醇的变化
• 6.1 ALDH 缺失突变株（MH）和ADHE 缺失突变株（ME）比酶活的测定
• 6.2 ALDH 缺失突变株（MH）和ADHE 缺失突变株（ME）乙醇的产生
• 6.3 ALDH 缺失突变株（MH）和ADHE 缺失突变株（ME）1,3-丙二醇的生成
• 6.3.1 第I 批发酵实验
• 6.3.2 第II 批发酵实验
• 6.4 ALDH 突变株（MH）和ADHE 缺失突变株（ME）厌氧发酵乙醇的生成
• 6.5 小结
• 第7章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表