论文摘要
背景男性冠心病的发病率和病死率均明显高于同龄绝经前女性。近年来有关雄激素在男性动脉粥样硬化性疾病包括冠心病发病中的作用逐渐受到关注。有研究显示,男性冠心病患者血循环睾酮水平明显降低;长期口服高剂量睾酮制剂或经皮补充低剂量睾酮可改善男性心绞痛症状积分和心肌缺血的客观指标;在男性冠心病患者冠脉内注入生理浓度睾酮可增加冠脉直径和冠脉内血流;动脉粥样硬化好发于老年男性,而老年男性睾酮水平明显降低,提示睾酮与动脉粥样硬化之间存在关联。汇总临床流行病学研究的结果,没有研究支持睾酮与冠心病的正相关。血管内皮细胞的OX-LDL氧化损伤是动脉粥样硬化的发生过程中重要的始动环节。已经发现在心房、心室肌纤维、动脉内皮细胞及血管平滑肌细胞均有雄激素受体(AR)表达。雄激素只在AR存在的靶组织中才能行使其生物学功能,雄激素作用的强弱与细胞内AR含量密切相关。研究显示,AR的表达和功能受AR基因外显子1区(CAG)n多态性的调控。因此要研究雄激素对动脉粥样硬化的影响,AR是关键环节,而AR基因(CAG)n多态性与雄激素和冠心病的关系并不明确。本研究旨在通过对雄激素—雄激素受体—动脉粥样硬化三者之间关系的研究,以及雄激素受体基因CAG多态性对AR表达影响的研究,从基因和细胞水平探讨AR在动脉粥样硬化中发挥的作用。目的(1)研究AR基因(CAG)n多态性对AR mRNA和AR蛋白表达的影响;(2)研究不同浓度的睾酮预处理对ECV304氧化损伤后NO、PAI-1、ICAM-1、PDGF-B和TGF-β1的变化,探讨睾酮在动脉粥样硬化中可能的作用机制。(3)研究含不同CAG重复数AR基因的ECV304氧化损伤后,睾酮干预治疗作用的差别。方法(1)以pwtAR质粒和已鉴定CAG重复数的白细胞基因组DNA为基础,通过重组PCR、酶切、连接等方法构建含CAG重复数为0,8,21,34的AR表达质粒;(2)将含CAG重复数0,8,21,34的AR表达质粒转染HEK293细胞,TRIZOL提取总RNA,用于RT-PCR检测AR mRNA;细胞裂解液提取总蛋白,用于Western Blot检测AR蛋白。分析并比较不同的CAG重复对AR转录及翻译的影响;(3)MTT法检测不同浓度睾酮干预对ECV304细胞增殖的影响,连续观察96h;(4)RT-PCR比较不同浓度睾酮干预后ECV304细胞AR mRNA水平的差别;(5)ECV304细胞分组,分别加入OX-LDL、不同浓度睾酮预处理+OX-LDL和氟他胺(Flu,AR拮抗剂)预处理+OX-LDL,孵育30h后,收集培养液上清,硝酸还原酶法检测NO,ELISA法检测PAI-1;收集细胞加裂解液提取蛋白,Western Blot检测ICAM-1、PDGF-B和TGF-β1;(6)将含CAG重复数0,8,21,34的AR表达质粒转染ECV304细胞,之后用OX-LDL氧化损伤12h,加不同浓度的睾酮干预24h,按照步骤(5)中的方法检测相应指标。结果(1)成功构建了含CAG重复数为0,8,21,34的AR表达质粒,经酶切、测序和序列比对,证实插入片段的大小、方向、阅读框和CAG重复长度正确;(2)CAG重复数与AR mRNA和蛋白水平之间的关系:对AR mRNA,CAG0最低,CAG34居中,CAG8和GAG21最高;对AR蛋白,CAG8最低,CAG34居中,CAG0和GAG21最高。二者的变化并不一致;(3)低生理及生理浓度(3~30nM)的睾酮对内皮细胞的生长无不良影响;而超生理浓度睾酮(3μM~30μM)36h后,高生理浓度睾酮(300nM)48h后内皮生长速度减慢。随着睾酮作用时间的延长差别越发明显,生长曲线增长幅度明显变缓;(4)ECV304细胞AR mRNA转录水平随睾酮浓度的增加而增加,在低~高生理浓度范围(3nM~300nM)内基本一致,在超生理浓度(3~30μM)表达量进一步增加;(5)不同浓度睾酮预处理对OX-LDL氧化损伤ECV304细胞后各指标检测的结果:OX-LDL引起NO、TGF-β1表达降低,PAI-1、ICAM-1和PDFGF-B表达增加;与OX-LDL组相比,T 3nM和T 30nM预处理除对PAI-1和ICAM-1表达无逆转作用外,PDGF-B进一步降低,而在NO和TGF-β1的影响上前者继续下降,后者有增加作用;T 300nM~30μM作用相似,对ICAM-1和PDGF-B有抑制作用,对TGF-β1有促进作用,但T 3~30μM对NO和PAI-1的变化无明显逆转;Flu预处理对PAI-1无明显影响,对其他OX-LDL损伤指标的变化有拮抗作用;(6)ECV304细胞转染pAR-CAGn的效果不理想,未能就AR基因(CAG)n多态性对氧化损伤的内皮细胞(动脉粥样硬化模型)的影响作更加深入的研究。结论(1)重组PCR是可行的、有效的基因重组和基因缺失突变方法;(2)在本研究所选取的CAG重复数上,未发现CAG重复数(0,8,21,34)与AR mRNA和蛋白水平之间的线性关系,在CAG21的AR mRNA和蛋白表达量均较高,与人群中CAG重复数的中位数相近;(3)超生理浓度睾酮对ECV304的细胞增长有明显的抑制作用;(4)睾酮对ECV304 AR mRNA的表达有剂量依赖性增加的作用;(5)低生理浓度睾酮对氧化损伤的ECV304无保护作用,而生理浓度、高生理浓度和超生理浓度的睾酮对氧化损伤的ECV304保护的机制不尽相同。氟他胺(AR拮抗剂)对氧化损伤的ECV304也有保护作用,确切的机制不明。
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