5株PRRSV ORF3，5，6基因的变异分析及ORF3-5串联基因重组腺病毒的构建

论文摘要

本试验通过对PRRSV 5 株广东流行株ORF3, 5, 6 3 个基因的分析,探讨广东省5株流行株之间及其与其他毒株间的遗传变异关系,为探索广东省PRRSV 的来源、分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据,同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。另外将腺病毒表达系统与PRRSV 的主要抗原多肽的基因有机地结合起来,利用腺病毒对动物体细胞的广泛感染性,改善PRRSV 的GP3、GP5 对动物免疫系统的刺激效率和方式,模拟PRRSV病毒的自然感染过程,以期更好地发挥PRRSV GP3、GP5 的抗原活性,为研制PRRSV高效安全的基因工程疫苗开辟新途径。本试验的主要内容及结果如下: 1.5 株PRRSV GD 株ORF3、ORF5、ORF6 基因的变异分析根据GeneBank 中发表的序列分别设计合成了针对PRRSV ORF3, ORF5 和ORF6 基因的引物,利用RT-PCR 方法从广东省送检的5 份可疑病料中均分别扩增得到大小约787bp、630bp、550bp 的片段,克隆入pMD18-T 载体并测序。应用DNAStar 软件分析所测的序列,与国内外已发表毒株和疫苗株（RespPRRS/Repro、RespPRRS MLV）及LV4.2.1 等毒株的序列进行比较,结果表明:广东省的5 个毒株在遗传关系上接近HB-1（sh）株,本研究中分离于不同猪场的5 个毒株间的核苷酸序列差异不显著,可能有共同的来源。2.PRRSV ORF3-5串联基因重组腺病毒的构建用WP3L和WP3R引物从pT-ORF3阳性质粒上扩增完整的ORF3 片段,利用T-A 连接的原理将片段亚克隆入pMD18-T 载体EcoV 处,按常规方法转化DH5a,筛选出正向重组质粒并测序,命名为pMD-ORF3。用WP5L和WP5R引物从pT-ORF5 阳性质粒上扩增ORF5 基因,用Sph I/Hind III 双酶切后回收目的片段,将重组质粒pMD-ORF3 也经Sph I/Hind III 双酶切并去磷酸化,与目的片段于16℃连接,按常规方法筛选出重组阳性质粒并测序,命名为pMD-ORF3-5。用Not I/HindIII 从重组质粒载体pMD-ORF3-5上切取ORF3-5 基因插入pAdTrack-CMV穿梭载体,挑取卡那霉素（Kan+）抗性的单菌落,按常规方法获得阳性重组子pAdTrack-CMV-3-5。将构建的携有PRRSV ORF3-5 串联基因的重组穿梭载体Pme I 线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1 共转染E.coli BJ5183,使之同源重组,经PCR、酶切鉴定获得重组腺病毒质粒pAdCMV-3-5,然后用Pac I 线性化,用脂质体介导转染入人

论文目录

• 文献综述
• 第一章 猪生殖与呼吸综合征及其病原的研究进展
• 1.1 猪生殖与呼吸综合征病毒的起源和分类
• 1.2 猪生殖与呼吸综合征病毒生物学特性
• 1.2.1 病毒的形态特征
• 1.2.2 病毒的侵入和释放
• 1.2.3 病毒的培养特性
• 1.2.4 病毒的抵抗力
• 1.2.5 病毒的血凝特性
• 1.3 猪生殖一呼吸综合征病毒分子生物学研究
• 1.3.1 病毒的基因组结构与特点
• 1.3.2 病毒基因组编码的蛋白的结构、功能
• 1.3.3 病毒的复制特点
• 1.3.4 PRRSV的分子遗传变异
• 1.4.P RRSV的流行病学研究
• 1.4.1 宿主因素
• 1.4.2 病毒因素
• 1.4.3 疫苗因素
• 1.4.4 饲养管理与环境因素的影响
• 1.5 PRRS 的临床症状
• 1.6 PRRS 发生后猪的组织病理学变化
• 1.6.1 胎儿、新生仔猪
• 1.6.2 哺乳仔猪
• 1.6.3 母猪
• 1.7 诊断研究
• 1.7.1 病毒分离
• 1.7.2 抗原检测
• 1.7.3 血清学试验检测抗体
• 1.7.4 分子生物学检测方法
• 1.8 免疫学研究
• 1.8.1 对免疫细胞的影响
• 1.8.2 体液免疫
• 1.8.3 细胞免疫
• 1.8.4 细胞因子的产生
• 1.8.5 抗体依赖性增强作用
• 1.9 疫苗免疫及防制策略
• 第二章 腺病毒表达系统研究进展
• 2.1 腺病毒的基本结构
• 2.2 腺病毒的感染机制
• 2.3 腺病毒载体的研究进展
• 2.4 腺病毒重组基因工程疫苗的特性
• 2.5 腺病毒载体的发展前景
• 2.6 论文设计思路
• 试验研究
• 第三章 PRRSVGD分离株ORF3,5,6基因的变异分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌种、质粒
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要药品及试剂
• 3.1.4 实验方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 目的基因的扩增
• 3.3.2 重组质粒的酶切和PCR鉴定
• 3.3.3 DNA 序列测定
• 3.3.4 同源性分析
• 3.3.5 遗传进化树
• 3.4 讨论
• 第四章 PRRSVORF3-5串联基因重组腺病毒的构建
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种、质粒
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 主要药品及试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 ORF3 基因克隆入质粒pMD 18-T（pMD-ORF3）
• 4.2.2 ORF5 基因克隆入质粒pMD-ORF3（pMD-ORF3-5）
• 4.2.3 构建含ORF3-5 基因的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-3-5
• 4.2.4 转染pAdEasy-1 和pAdTrack-CMV-3-5 进行同源重组
• 4.2.5 重组腺病毒AdCMV-3-5 的制备
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 PRRSV ORF3 基因的PCR 扩增
• 4.3.2 pMD-ORF3 的酶切和PCR 鉴定
• 4.3.3 ORF5 基因的PCR 扩增
• 4.3.4 pMD-ORF3-5 的酶切和PCR 鉴定
• 4.3.5 重组穿梭载体pAdTrack-CMV-3-5 的构建
• 4.3.6 pAdTrack-CMV-3-5 的PCR 和酶切鉴定
• 4.3.7 同源重组腺病毒质粒pAdCMV-3-5 的构建及鉴定
• 4.3.8 重组腺病毒AdCMV-ORF3-5 及其表达产物的鉴定
• 4.4 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 英文缩略词及中英文对照
• 作者简介