基于核酸酶信号放大单碱基多态性分析

论文摘要

核酸探针设计简单、稳定性好,具有高选择性、高特异性及易合成修饰和信号机制转换灵活等优势,已被广泛应用于分析化学、生物医学、疾病诊断治疗与新药研发等方面。信号放大技术,尤其是利用工具酶结合其他分析检测手段的信号放大技术,由于其方法简单,灵敏度和特异性高,反应时间相对较短,近年来在核酸、蛋白质、重金属等物质痕量分析方面的得到了迅速发展。基于以上考虑,本文着眼于核酸探针灵活的信号转换机制和核酸酶的特异性,将核酸探针与核酸酶相结合,实现高灵敏、特异性核酸检测及单碱基多态性分析,包括如下两个方面的工作:（1）基于RNase H的特异性作用和二氢卟吩Ce6的光敏特性,发展了一种结合酶切和单线态氧双重信号放大单碱基多态性分析。当有完全互补DNA存在时,基于RNase H的特异性作用实现循环放大,多次循环后,探针以单链形式存在并被吸附到单壁碳纳米管表面,二氢卟吩Ce6的光敏活性猝灭。当靶DNA和探针在RNA碱基处存在错配时,探针不能吸附到单壁碳纳米管表面,二氢卟吩Ce6促使单线态氧的持续产生。通过检测两种情况下溶液中单线态氧捕获剂SOSG的荧光差异实现了高灵敏、特异性单碱基多态性分析。该方法设计简单,灵敏度高,有望发展成为一种通用的单碱基多态性分析方法。（2）结合RNase H的特异性作用和G-四链体的过氧化物酶活性,发展了一种免标记放大单碱基多态性分析。当有完全互补序列存在时,与核酸探针形成双链结构,由于RNA碱基被特异性识别和切割,释放出目标序列,与下一个核酸探针分子结合。经过多次循环后,两段G-四链体的部分序列在溶液中相互远离,具有较弱的过氧化物酶活性。反之,当有单碱基错配序列存在时,RNase H不能特异性识别和切割RNA碱基,具有较强的过氧化物酶活性。通过检测溶液吸收强度的不同实现了单碱基多态性的灵敏、特异性区分。该方法为单碱基多态性分析提供了一种免标记、放大检测途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 本文所用英文缩略词表
• 第1章 绪论
• 1.1 核酸探针的信号转换方法
• 1.1.1 核酸探针的比色检测方法
• 1.1.2 核酸探针的荧光检测方法
• 1.1.3 核酸探针的电化学检测方法
• 1.2 核酸探针信号放大识别方法
• 1.2.1 荧光定量PCR 信号放大技术
• 1.2.2 滚环复制信号放大技术
• 1.2.3 DNA 链置换信号放大技术
• 1.2.4 DNA 分子机器扩增技术
• 1.3 核酸酶在核酸探针检测中的应用
• 1.4 单碱基多态性简介
• 1.4.1 单碱基多态性的概念及检测意义
• 1.4.2 单碱基多态性的检测原理及方法
• 1.5 本论文的选题依据和研究内容
• 第2章 基于酶切反应和单线态氧双重信号放大单碱基多态性分析
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 主要试剂与仪器
• 2.2.2 缓冲溶液配置
• 2.2.3 荧光光谱测量
• 2.2.4 实验可行性研究
• 2.2.5 检测条件优化
• 2.2.6 方法特异性考察
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 检测原理
• 2.3.2 实验可行性研究
• 2.3.3 光敏剂二氢卟吩Ce6 光照时间选择
• 2.3.4 SWNTs 浓度选择
• 2.3.5 RNase H 反应时间选择
• 2.3.6 单碱基突变检测
• 2.4 小结
• 第3章 基于RNA 酶切反应的免标记信号放大单碱基多态性分析
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 主要试剂与仪器
• 3.2.2 缓冲溶液配置
• 3.2.3 光谱测量
• 3.2.4 实验可行性研究
• 3.2.5 检测条件选择
• 3.2.6 方法特异性考察
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 检测原理
• 3.3.2 实验可行性研究
• 3.3.3 离子强度选择
• 3.3.4 血晶素浓度选择
• 3.3.5 温度影响
• 3.3.6 pH 选择
• 3.3.7 单碱基突变检测
• 3.4 小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢