论文摘要
目的:最近几十年,来源于高等植物、藻类、地衣及大型真菌的植物多糖,因其广谱治病性、低毒且副作用小的特点已经引起生物医学界极大的关注。植物多糖已经成为理想的免疫调节和抗肿瘤新药的候选。从众多的植物多糖中筛选出抗肿瘤和免疫调节作用好的多糖是目前医药学界重要的任务之一。刺五加（Acanthopanax senticosus Harms）,又名五加参、刺拐棒,属于五加科,是一种珍贵药用植物,作为一种传统的中药,很久以前就用于治疗许多种疾病,如脑血管病、糖尿病、肿瘤、心血管病、高血压、风湿性关节炎等,也用于减缓压力和疲劳。刺五加中含有多种有效成分如甙类、苷类、三萜类、黄酮、多糖、维生素和矿质元素等,这些成分有不同的生物学活性。刺五加多糖（Acathopanas senticosus Polysacharides, ASPS）是从刺五加的根及茎皮中提取出的生物活性多糖,具有提高免疫力、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血糖和降血脂、抗衰老等作用。实验证明ASPS可以增加淋巴细胞的增殖、促进巨噬细胞的吞噬。可以显著抑制S180的生长、延长荷瘤鼠的存活时间,但是对其抗肿瘤、免疫调节作用的机制还不清楚。本研究首先用ASPS与经过实验证明具有抗肿瘤作用和免疫调节作用的植物多糖,即来自高等植物的黄芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）来自大型真菌的灵芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharides,GLP）和滑菇多糖（Pholiota nameko polysacharides,PNP）,通过MTT法等,对白血病细胞株K562的抑制作用及对小鼠体外脾淋巴细胞转化作用进行比较研究。在此基础上选取了不同来源的肿瘤细胞株即K562、H446、SMMC-7721、BGC、HeLa细胞株,选出ASPS抑制作用最强的细胞株。然后采用MTT、流式细胞技术、Hoechst33258染色、Western印迹、免疫荧光细胞化学方法、RT-PCR等方法进一步从细胞水平、分子水平研究ASPS对肿瘤细胞凋亡及其相关基因表达的影响,对细胞周期阻滞及相关的细胞信号通路的影响,对腹腔巨噬细胞的体外激活作用及细胞因子产生的影响。为ASPS的开发利用提供理论基础。材料与方法: 1.四种植物多糖的抗肿瘤及免疫调节作用比较四种植物多糖由河北师范大学生命科学学院生化与分子生物学实验室提供。BALB/c小鼠由河北医科大学动物中心提供。1.1细胞培养K562、H446、SMMC-7721、BGC、HeLa细胞采用含有10%新生牛血清、青霉素100 u/mL、链霉素100μg/mL的RPMI-1640培养基。置于37℃,5%CO2,饱和湿度环境下培养。1.2 MTT检测抑制率取对数生长期的细胞,以1×105/mL细胞浓度接种于96孔培养板中,每孔加入100μL,24 h后加入100μL用无血清的RPMI1640培养基稀释的四种多糖,终浓度为25、50、100、200、400μg/mL。对照组加等量的无血清培养基。每种药物浓度均做8个复孔,在分别培养24、48、72 h后,每孔加MTT 20μL,继续培养4 h,离心（2000转/分）,10 min,弃去上清,每孔加二甲基亚枫150 mL,震荡10 min,用酶标仪测490 nm的A值。根据下列公式计算抑制率:抑制率=[（对照组A-实验组A）/对照组A]×100%,并根据以上结果用82798- IC50软件计算出四种多糖作用的半数抑制浓度（IC50）。1.3生长曲线的绘制取对数生长期的细胞,以8×104/mL细胞浓度接种于96孔培养板中,每孔加入1 mL,24 h后加入l mL用无血清的RPMI1640培养基稀释的多糖,终浓度为50,100,200,400μg/mL;对照组加等量的无血清培养基。每种多糖浓度均做4个平行孔。在培养至24、48、72、96、120 h后,用血细胞计数器计算每毫升溶液中细胞的数目,绘制生长曲线。1.4脾淋巴细胞制备处死小鼠,无菌切取小鼠脾脏,研磨器轻轻研磨,200目不锈钢网过滤,制成脾细胞悬液。用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,Hanks液洗涤2次,RPMI-1640培养液重悬细胞,调整细胞浓度为6×106/mL。1.5多糖对脾淋巴细胞转化的影响96孔培养板中每孔加入100μL脾细胞悬液,再加入100μL不同浓度的多糖样品。每一样品均设有加ConA（终浓度为5 g/mL）的实验组与不加ConA对照组,同时设不加样品的阴性对照组。每组设8孔重复,置37℃,5% CO2饱和湿度条件下培养48 h。培养结束前4 h,每孔加入20μL MTT（2 mg/mL）,继续培养4 h,每孔加入DMSO 150μL裂解细胞后,用酶联免疫检测仪于490 nm波长下测定A值,计算刺激指数,SI =实验组A/对照组A。1.6 ASPS对不同肿瘤细胞株的抑制作用的比较研究采用MTT法。2. ASPS诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡2.1 ASPS对H446细胞增殖的抑制作用,采用MTT法。2.2 Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡取对数生长期的细胞,以1×105个/mL细胞浓度接种于24孔板中,每孔瓶加入1 mL。24 h后加入1 mL用无血清的RPMI 1640培养基稀释的ASPS,终浓度为240、480、960μg/mL。对照组加1 mL无血清培养基。每组均做3个复孔,置培养箱中继续培养,48 h后,用PBS（pH 7.2）漂洗2次,多聚甲醛室温固定30 min,蒸馏水洗3次。Hoechst 33258（5 mg/L）染色。30 min后蒸馏水漂洗除去染液,荧光显微镜观察照相。2.3流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡率EDTA消化收集细胞,冷PBS洗3次,70%乙醇固定细胞24 h,上机测定前离心去乙醇,用PBS洗两次,加100μg/mL RNase 37℃消化30 min。50μg/mL碘化丙锭（propidium iodide,PI）染色30 min,经尼龙网过滤后,用FACSTARCalibur型流式细胞仪测定。实验结果经计算机软件ModFit LT2.0处理,计算凋亡率。2.4 western印迹分析检测ASPS对p53、bcl-2、bax基因表达水平的影响提取细胞全蛋白,用考马斯亮兰G250试剂盒测定蛋白浓度。每梳孔加150μg样品蛋白。采用SDS-PAGE不连续变性蛋白质电泳,电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部,参照标准分子量蛋白质,截取相应位置的凝胶转膜,封闭后结合一抗,4℃过夜,漂洗后与辣根过氧化物酶标记的二抗结合,化学发光显色,将X光胶片扫描后,采用UVP-Lab work 4.60分析软件分析条带光密度。并分析结果。以目标基因与β-肌动蛋白基因产物的吸光度比值计算表达水平。2.5免疫荧光细胞化学方法检测ASPS对p53、bcl-2、bax基因表达的影响细胞处理同2.2,终止培养后,弃掉培养液,PBS洗3次,细胞载片4 %的多聚甲醛30 min。0.3%Triton X-100孵育1次20 min,PBS清洗标本3次各5 min,用3% H2O2去离子水室温孵育5 min,蒸馏水冲洗,按免疫荧光试剂盒说明进行免疫染色,溶性封片剂（PBS:甘油=1:1）封片。荧光显微镜观察。3. p-38、ERK通路在ASPS诱导人小细胞肺癌H446细胞G2/M期阻滞中的作用3.1流式细胞技术（FCM）检测细胞周期分布。方法同2.3。3.2 western印迹分析检测ASPS对ERK、p-ERK、p38、p-P38蛋白的影响方法同2.4。3.3免疫荧光细胞化学方法检测ASPS对p-ERK、p-P38蛋白的影响方法同2.5。4. ASPS的免疫调节作用4.1巨噬细胞的收集和培养实验前3天,给小鼠腹腔注射1mL可溶性淀粉,处死小鼠,腹腔内注射PBS液5 mL,轻揉腹部,在腹膜中央剪一小口,用吸管抽出灌洗液。1 000 r/min离心10 min ,用Hanks液离心洗涤细胞两次,RPMI-1640重悬细胞,调整细胞浓度为106/mL,种在96孔板中,37℃、5 %CO2培养2～4 h,弃上清,用37℃预温的PBS洗涤2次,洗去未贴壁的细胞,贴壁的为腹腔巨噬细胞。4.2细胞活力检测采用中性红法检测细胞活力。ASPS处理48 h的腹腔巨噬细胞,PBS洗涤,加入新鲜配制的中性红50 ng/mL工作液,在37℃、浓度5 % CO2条件下,培养3 h。弃去上清液,用PBS洗涤一遍,加入萃取液（乙醇∶水∶醋酸=50∶49∶1）,酶标仪检测540 nm的吸光值。活力计算公式如下:细胞活力= [加药孔（A）/对照孔（A）]×100 %。4.3 NO的测定腹腔巨噬细胞ASPS处理48 h,取上清液,然后按试剂盒说明操作。酶标仪检测550 nm处光吸收值。用下列公式计算NO的浓度:NO含量=（[测定管A -空白管A）（/标准管A-空白管A）]×标准品浓度（100μmol/L）。4.4 RT-PCR检测TNF-a、IL-1、IL-2表达水平:ASPS处理脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞,Trizol法提取细胞总RNA,采用随机引物法以M-MLV合成cNDA,以特异的引物扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳后,图像分析系统分析扩增条带光密度值,以β肌动蛋白为内参,计算mRNA相对表达水平。结果: 1.四种植物多糖抗肿瘤及免疫调节作用的比较1)四种多糖对K562细胞的抑制作用:四种多糖对K562细胞增殖的抑制率均随多糖浓度的升高及作用时间的延长而增大,ASPS在每个浓度下抑制作用都明显高于其他三种多糖。ASPS在作用24 h后对K562细胞的抑制率明显高于其他三种多糖,在作用48 h、72 h后ASPS的抑制率与APS没有差异,但都高于GLP和PNP。通过MTT实验结果测得在作用48 h时A值,计算出ASPS、APS、GLP、PNP作用的半数抑制浓度（IC50）依次是:118.84、162.42、270.26、302.79μg /mL,ASPS对K562细胞抑制作用的IC50值明显低于其它三种多糖。2)四种多糖对小鼠体外脾淋巴细胞增殖的影响:多糖对小鼠脾淋巴细胞的刺激指数比较的结果,ASPS、PNP、GLP的在选择的浓度范围内对小鼠脾淋巴细胞都有刺激作用（刺激指数>1）,随ASPS和PNP浓度增大对小鼠脾淋巴细胞的刺激指数增加,二者之间无差异,而GLP在25、50、100μg/mL随浓度增加增大,而后随多糖浓度的升高而降低。三种多糖的刺激指数在同一浓度下对静止型和激活型小鼠脾淋巴细胞之间没有差异。APS对小鼠体外脾淋巴细胞的增殖没有刺激作用。3)ASPS对不同肿瘤细胞株的抑制作用的比较:ASPS对不同肿瘤细胞株的抑制率,在所选择的浓度范围内ASPS对K562和H446细胞抑制率都显著大于BGC和HeLa细胞,在100μg/mL及以上浓度时对K562抑制率大于H446和SMMC-7721,而在200、400μg/mL时对H446的抑制率大于SMMC-7721细胞。2. ASPS诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡1)MTT法检测药物对H446细胞增殖的抑制作用:随ASPS浓度的增加,ASPS对H446细胞增殖抑制作用增加,各浓度多糖处理组对H446细胞增殖的抑制率与对照组相比明显增大,P<0.01,差异有统计学意义。通过MTT实验结果（48 h的A值）,计算ASPS对H446细胞抑制作用的半数抑制浓度（IC50值）为476.36μg/mL。2)Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡的形态特征:对照组细胞的细胞核界限清晰,圆形或椭圆形,呈均匀蓝色荧光,染色质分布均匀。ASPS处理后的细胞,染色质分布不均匀,部分细胞细胞核缩小,染色质凝集,呈颗粒团状分布,有的核碎裂形成多个球形颗粒。3) FCM检测细胞凋亡率:对照组凋亡峰很低,随着ASPS处理浓度的加大,凋亡峰越来越明显。通过计算得出各组凋亡率,对照组及240、480、960μg/mL ASPS处理组凋亡率分别是:（5.02±0.4）%,（11.12±1.8）%,（19.89±2.5）%,（22.54±1.8）%,各浓度多糖处理组与对照组相比细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.01）。4) ASPS对细胞凋亡相关基因表达的影响: Western blot实验分析ASPS对p53、bcl-2、bax基因表达的影响: p53基因表达与对照组相比明显提高,但表达量与浓度依赖关系不明显;随ASPS浓度的增大bcl-2基因的表达明显降低,bax基因的表达明显增高,Bcl-2/Bax下降。免疫荧光细胞化学法分析ASPS对p53、bcl-2、bax基因表达的影响:随ASPS处理浓度的增加Bax、P53蛋白的红色荧光强度呈增强的趋势。Bcl-2呈现相反的现象。3. p-38、ERK通路在ASPS诱导人小细胞肺癌H446细胞G2/M期阻滞中的作用1)流式细胞技术（FCM）检测细胞周期分布: H446细胞各浓度ASPS处理组与对照组相比,G0/G1期细胞所占的百分数,都没有差异;S期细胞所占的比例随ASPS浓度的增加呈递减的趋势, G2/M期所占的比例明显增高。2) ASPS对H446细胞ERK、p-ERK、p38、p-p38蛋白的影响: Western blot实验分析ASPS对ERK、p38的表达量,处理组与对照组相比没有差异,而p-ERK、p-P38的量各浓度ASPS处理组都显著高于对照组。免疫荧光细胞化学分析ASPS对p-P38、p-ERK蛋白水平的影响:不同浓度的ASPS处理后与对照组相比p-p38、p-ERK蛋白的红色荧光强度显著加深。4. ASPS的免疫调节作用1) ASPS对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响:对照组及100、200、400μg/mL ASPS处理组,吞噬活性分别是100%、（152.38±10.42）%、（190.45±11.20）%、（261.90±18.32）%,说明ASPS有较强的促巨噬细胞吞噬中性红的作用,并呈现一定的浓度相关性。2) ASPS对小鼠腹腔巨噬细胞NO产生的影响:对照组及100、200、400μg/mL ASPS处理组NO2-浓度明分别是6.90±0.89、10.15±1.57、13.68±1.89、17.65±2.10,处理组NO2-浓度明显高于对照组,并呈现一定的浓度相关性。3) ASPS对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α,IL-1,IL-2 mRNA表达的影响:细胞经ASPS处理后,用RT-PCR方法检测TNF-α、IL-1,IL-2的表达水平,结果表明ASPS处理组TNF-α、IL-1的表达高于对照组,IL-2在腹腔巨噬细胞中不表达,ASPS处理不影响β-actin的表达。4) ASPS对小鼠脾淋巴细胞TNF-α, IL-1,IL-2 mRNA表达的影响:细胞经ASPS处理组后,用RT-PCR方法检测TNF-α、IL-1、IL-2的表达水平,结果表明ASPS处理组TNF-α、IL-2的表达高于对照组,呈浓度依赖关系,IL-1在小鼠脾淋巴细胞中不表达,ASPS处理不影响β-actin的表达。结论:1.四种植物多糖对K562细胞的增殖都具有抑制作用,ASPS的抑制作用高于APS、GLP和PNP。2. ASPS、GLP、PNP能诱导对小鼠体外脾淋巴细胞的增殖,ASPS、PNP诱导作用较强。三种多糖对小鼠体外脾淋巴细胞增殖的诱导与ConA之间没有协同作用。3. ASPS对K562、H446细胞增殖的抑制作用大于对SMMC-7721、BGC、HeLa细胞。4. ASPS能抑制H446细胞的增殖并能诱导H446细胞凋亡,诱导细胞凋亡的机制可能通过上调凋亡相关基因p53表达,进一步引起bax基因的表达上调,bcl-2表达下调实现。5. ASPS通过激活ERK和p38通路诱导H446细胞发生G2/M期阻滞。6. ASPS能激活小鼠腹腔巨噬细胞,增加细胞因子的产生。
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