PEG化的哌唑嗪—量子点定位α1B-肾上腺素受体及药物筛选模型的建立

论文摘要

本文第一章首先阐述了在细胞、分子水平上的药物筛选技术中常用的荧光技术。荧光技术因为其灵敏度高、方法简便成为药物的高通量及高内涵筛选中常用的技术,其中重点介绍了本实验中涉及到的两种技术-全内反射荧光显微术及流式细胞术。其次介绍了实验中所涉及到的肾上腺素受体,并从空间结构方面分析了受体与配体的耦合情况。随后对实验中所用到的荧光染料-量子点的修饰和生物共轭方面的情况进行了详细的介绍,特别是高分子PEG在量子点的修饰中发挥的重要作用,量子点经过修饰以后,荧光特性得到更好的改善。最后对基于经过修饰的量子点探针在药物筛选方面的应用进行了综述。本文第二章首先从肾上腺素受体的结构出发,利用计算机模拟技术,从空间结构上分析肾上腺素受体与拮抗剂Prazosin-PEG-biotin分子的耦合情况,从理论上确定PEG分子的长度,此长度时配体上所连接的量子点能伸出受体的空穴之外,这样得到的Prazosin-PEG-QDs探针减少了由于量子点体积太大造成的空间位阻,能够与细胞膜上α1B-AR最大量的结合。另一方面,有文献报道,PEG分子量超过2000时,能够明显的减少QDs的非特异性吸附,综合考虑,确定了PEG的长度为2000,得到PEG功能化的Prazosin-PEG2ooo-biotin分子。用链霉亲和素化的量子点（streptavidin-QDs）耦合Prazosin-PEG2ooo-biotin,形成Prazosin-PEG2ooo-QDs,然后定位了HEK293aiB-AR细胞表面的α1B-AR。实验中我们对Prazosin-PEG2ooo-QDs的浓度和其与细胞的共孵育时间这两种影响受体标记的因素进行了研究,确定了Prazosin-PEG2ooo-QDs定位HEK293细胞膜上的α1B-AR的最佳条件,而且比较了Prazosin-QDs和Prazosin-PEG2ooo-QDs在相同浓度下,与α1B-AR结合的速率,证实了Prazosin-PEG2ooo-QDs明显能更快的结合到细胞膜上,实验结果说明在prazosin和QDs之间插入PEG2000后,可以减少量子点的空间位阻,大大缩短了其与细胞膜上受体结合的时间,而且很大程度上保持了膜受体和细胞的活性；同时表面没有表达α1B-AR的阴性细胞在相同浓度的Prazosin-PEG2000-QDs和Prazosin-QDs中,明显对前者的吸附较弱。通过这两个明显的变化,说明在经过PEG2000的修饰后,量子点的空间位阻和非特异性吸附问题都得到了很大的改善。本文第三章中,首先通过流式细胞术验证了通过TRIFM得出的Prazosin-PEG2ooo-QDs与细胞膜受体结合的最佳条件。同时验证了经过PEG修饰的Prazosin-PEG2ooo-QDs与细胞膜受体结合后细胞平均荧光强度大大高于相同条件下Prazosin-QDs处理过的细胞,而且Prazosin-PEG2ooo-QDs的非特异性吸附与Prazosin-QDs相比相对较少。在上述实验的基础上,将通过全内反射荧光显微术和流式细胞术两种方法结合对三种α1-AR拮抗剂进行了筛选,通过比较实验结果,确定了待筛选的拮抗剂与α1B-AR的亲和力的活性顺序是：卡维地洛>盐酸拉贝洛尔>盐酸阿呋唑嗪。经过PEG修饰后药物-量子点复合物,能够极大的缩短药物与细胞的孵育时间,使膜受体和细胞都保持更好的活性,提高了工作效率；而且HEK293α1B与修饰后的量子点结合后的平均荧光强度的提高,细胞对其的非特异性吸附作用的大大减少,使FCM统计细胞平均荧光强度时,阴阳性实验对比更加明显,使这个受体-配体的筛选模型筛选的效果更好。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 细胞分子水平上药物筛选技术中的常用荧光分析和成像技术
• 1.2.1 荧光分析技术
• 1.2.1.1 荧光强度分析法（FIA）
• 1.2.1.2 荧光共振能量转移技术（FRET）
• 1.2.1.3 荧光偏振技术（FP）
• 1.2.1.4 荧光相关光谱（FCS）
• 1.2.1.5 时间分辨荧光分析法（TRF）
• 1.2.1.6 荧光报告基因检测
• 1.2.1.7 流式细胞术（FCM）
• 1.2.2 荧光成像技术
• 1.2.2.1 共聚焦激光扫描显微成像技术（CLSM）
• 1.2.2.2 荧光寿命成像技术（FLIM）
• 1.2.3 全内反射荧光显微术（TRIFM）
• 1.3 计算机模拟药物筛选技术
• 1.4 肾上腺素受体（AR）
• 1.4.1 肾上腺素受体的结构
• 1.4.2 作用于α1-AR的拮抗剂
• 1.5 量子点的合成、表面修饰及生物共轭
• 1.5.1 量子点的合成
• 1.5.2 量子点的表面修饰
• 1.5.2.1 核壳结构包覆修饰
• 1.5.2.2 化学修饰
• 1.5.3 量子点的生物共轭
• 1.5.4 PEG在量子点的修饰中的作用
• 1.6 经过修饰的量子点探针在药物筛选中的应用
• 1.7 展望
• 1B-肾上腺素受体'>第二章 PEG化的哌唑嗪-量子点定位α_1B-肾上腺素受体
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 计算机模拟受体与药物的对接
• 2.2.4 细胞培养
• 2.2.5 PEG化的哌唑嗪的荧光标记
• 1B-AR荧光图像的获取方法'>2.2.6 活细胞上α_1B-AR荧光图像的获取方法
• 2.2.7 浓度的选择
• 2.2.8 时间的选择
• 2.2.9 特异性结合实验
• 2000-QDs与Prazosin-QDs的比较'>2.2.10 Prazosin-PEG₂₀₀₀-QDs与Prazosin-QDs的比较
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 计算机模拟受体与药物的对接
• 2.3.2 浓度的选择
• 2.3.3 时间的选择
• 2.3.4 特异性结合实验
• 2000-QDs与Prazosin-QDs的比较'>2.3.5 Prazosin-PEG₂₀₀₀-QDs与Prazosin-QDs的比较
• 2.4 结论
• 1B-AR和Prazosin-PEG₂₀₀₀-QDs的药物筛选模型的建立'>第三章 基于α_1B-AR和Prazosin-PEG₂₀₀₀-QDs的药物筛选模型的建立
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 细胞培养及流式细胞前处理
• 1B-AR荧光图像的获取'>3.2.4 活细胞上α_1B-AR荧光图像的获取
• 3.2.5 FCM测定细胞的荧光强度
• 3.2.6 FCM测定最佳条件的获取
• 3.2.6.1 浓度的选择
• 3.2.6.2 时间的选择
• 2000-QDs与Prazosin-QDs的比较'>3.2.6.3 Prazosin-PEG₂₀₀₀-QDs与Prazosin-QDs的比较
• 3.2.7 三种拮抗剂与哌唑嗪的亲和力比较
• 3.2.7.1 TRIFM获得荧光图像
• 3.2.7.2 FCM获得细胞的平均荧光强度
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 FCM测定最佳条件的获取
• 3.3.1.1 浓度的选择
• 3.3.1.2 时间的选择
• 2000-QDs与Prazosin-QDs的比较'>3.3.1.3 Prazosin-PEG₂₀₀₀-QDs与Prazosin-QDs的比较
• 1B-AR的亲和力比较'>3.3.2 三种拮抗剂与α_1B-AR的亲和力比较
• 3.3.2.1 全内反射荧光显微镜获得荧光图像
• 3.3.2.1.1 10倍待筛选药物竞争
• 3.3.2.1.2 50倍待筛选药物竞争
• 3.3.2.2 FCM获得细胞的平均荧光强度
• 3.3.2.2.1 10倍待筛选药物竞争
• 3.3.2.2.2 50倍待筛选药物竞争
• 3.4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表