论文摘要
背景:转移是恶性肿瘤患者死亡率高、预后差的根本原因。恶性肿瘤的区域性淋巴结转移是影响上皮来源恶性肿瘤患者预后的最重要因素。研究并最终弄清楚恶性肿瘤淋巴道转移的机制,在此基础上发展出有效的干预手段,对于提高恶性肿瘤患者的生存率有重要意义。Hca-F和Hca-P是利用可移植性小鼠腹水性肝癌细胞（H22）接种于有正常免疫功能的615小鼠足垫,经多次淋巴系统筛选得到的两个来源于同一亲本细胞但淋巴道转移能力明显不同的细胞株。其中Hca-F是具有高转移潜能的细胞株,淋巴结转移率高于70%;Hca-P是低转移潜能的细胞株,淋巴结转移率低于30%。两株细胞主要差异集中在淋巴道转移表型上。在本研究组此前针对Hca-F细胞和Hca-P细胞的系列研究中,利用抑制性消减杂交技术及高通量基因芯片技术筛选出了在Hca-F细胞和Hca-P细胞的差异表达基因;并采用定量蛋白质组学技术建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞荧光差异蛋白表达图谱,经质谱鉴定得到17个蛋白质,其中膜联蛋白7（Annexin A7）在Hca-F细胞中的表达高于Hca-P细胞,提示Annexin A7可能与小鼠肝癌的淋巴道转移潜能相关。由于在人类组织细胞中也有Annexin A7同源蛋白,我们认为研究小鼠肝癌Annexin A7与淋巴道转移机制的相关性,对人类肝癌淋巴道转移的的防治有重要意义。由此确定以Annexin A7为研究对象,探索其在Hca-F细胞株淋巴道转移过程中的作用,经检索,国内外未见同样的研究报道。目的:①构建pcDNA3.1-Annexin A7表达载体,稳定转染Hca-P细胞并获得Annexin A7的表达水平显著上调的Hca-P细胞株,同时建立稳定转染pcDNA3.1空载体的Hca-P细胞株作为对照。②构建pSilencer 3.1-shRNA表达载体,稳定转染Hca-F细胞并获得Annexin A7的表达水平显著下调的Hca-F细胞株,同时建立稳定转染pSilencer 3.1空载体的Hca-F细胞株作为对照。③解析Annexin A7表达水平的改变对小鼠肝癌细胞株Hca-F和Hca-P在细胞周期、细胞凋亡、细胞移动和侵袭能力等方面的影响,由此确定Annexin A7表达水平与小鼠肝癌细胞淋巴道转移潜能间的关系。方法:①利用Annexin A7编码序列（coding sequence, CDS）和PcDNA3.1（+）质粒经BamH I和EcoR I双酶切后连接纯化回收,抽提获得pcDNA3.1- Annexin A7质粒,并行PCR鉴定（鉴定引物为:5’-TGT CTAACCGTTCCAATGACC -3’, 5’-ACTAGAAGGCACAGTCGAGGC -3’这对引物扩增片段包含pcDNA3.1和Annexin A7序列各一部分,长度为923bp,）。在确定pcDNA3.1- Annexin A7质粒构建成功后行测序鉴定（引物: 5’-CTCACTATAGGGAGACCCAAGC-3’和5’-ACTAGAAGGCACA GTCGAGGC -3’）,以确定表达载体中Annexin A7序列无误。将pcDNA3.1- Annexin A7表达载体转染Hca-P细胞,并用含400ug/ml G418的完全培养基筛选,获得稳转pcDNA3.1- Annexin A7表达载体的Hca-P细胞,再行基因组DNA鉴定（引物:5’-TGTCTAACCGTTCCAATGACC -3’; 5’-ACTAGAAGGCACAGTCGAGGC -3’）后用荧光定量PCR和Western-blotting分别检测稳转pcDNA3.1- Annexin A7表达载体的Hca-P细胞中,Annexin A7在mRNA和蛋白质水平的表达。②由上海之江生物公司依据Gene Bank中小鼠Annexin A7基因序列（序列登录号:NM009674.3）合成三条shRNA的DNA模板的两条单链,分别命名为AnnexinA25;AnnexinA59;AnnexinA507,将pSilencer? 3.1-H1 neo质粒双酶切后分别与三条shRNA的DNA模板的退火后产物连接,对三条pSilencer3.1-shRNA表达载体经测序鉴定（引物为5’-GTTTTCCCAGT CACGAC-3’）确定无误后。将三条pSilencer3.1-shRNA表达载体分别以脂质体法瞬转Hca-F细胞,培养24h、48h、72h、96h后收集细胞,抽提RNA和蛋白,在mRNA和蛋白质水平检测三条shRNA对Annexin A7的表达的抑制作用,并设正常的Hca-F细胞为对照,以筛选出RNAi效果最好的shRNA。用RNAi效果最好的shRNA表达载体以脂质体法稳定转染Hca-F,用含400ug/ml G418的完全培养基筛选,获得pSilencer3.1- shRNA表达载体稳定转染的Hca-F细胞。从中取两瓶细胞抽提蛋白、RNA,采用荧光定量PCR和Western-Blottin检测shRNA转染后Hca-F细胞株中Annexin A7在mRNA和蛋白质水平的表达。③以六组细胞（分别为Hca-F细胞株、稳转pSilencer3.1空载体的Hca-F细胞株、稳转pSilencer3.1-shRNA表达载体的Hca-F细胞株、Hca-P细胞株、稳转pcDNA3.1空载体的Hca-P细胞株、稳转pcDNA3.1-Annexin A7表达载体的Hca-P细胞株）为实验对象。以MTT法检测pSilencer3.1-shRNA稳转Hca-F细胞、pcDNA3.1- Annexin A7稳转Hca-P细胞后对细胞活力和分裂增殖能力的影响;流式细胞技术检测pSilencer3.1-shRNA稳转Hca-F细胞、pcDNA3.1- Annexin A7稳转Hca-P细胞后对细胞周期和细胞凋亡的影响;Transwell实验检测pSilencer3.1-shRNA稳转Hca-F细胞、pcDNA3.1- Annexin A7稳转Hca-P细胞后对细胞迁移能力（不在Transwell上室中加人工基底膜）、和侵袭能力（在Transwell上室中加人工基底膜）的影响。结果:①成功构建pcDNA3.1- Annexin A7表达载体,经测序鉴定,所得到的载体中Annexin A7的CDS序列与Gene Bank中小鼠Annexin A7基因序列（序列登录号:NM009674.3）一致。pcDNA3.1- Annexin A7载体转染Hca-P细胞后,获得稳定上调表达Annexin A7的Hca-P细胞株;行基因组DNA鉴定,证实pcDNA3.1- Annexin A7已转入Hca-P细胞中, western-blotting结果显示转染前后蛋白的表达相对值（ Annexin A7/GAPDH ）分别为0.43544±0.0112和0.45957±0.0065 （P < 0.05）。②pSilencer3.1-shRNA表达载体,经DNA测序鉴定,所得到载体中的干扰序列与预设序列一致。经筛选后,将对Hca-F细胞中Annexin A7的表达抑制效果最好的pSilencer3.1-shRNA表达载体稳转Hca-F细胞株,获得稳定下调表达Annexin A7的Hca-F细胞株;采用荧光定量PCR和Western-Blottin检测结果提示:shRNA转染后Hca-F细胞株中Annexin A7在mRNA和蛋白质水平的表达远低于空载体组和正常Hca-F细胞株（P<0.05）。③流式细胞技术检测结果表明Annexin A7有促进细胞分裂增殖的作用;在Hca-F中沉默Annexin A7的表达后,细胞的凋亡数增加。在Hca-F中沉默Annexin A7表达之后,其迁移能力、侵袭能力均显著下降,在Hca-P中上调Annexin A7表达之后,其迁移能力显著增强,而侵袭能力无明显变化。结论:①利用pcDNA3.1（+）质粒和Annexin A7CDS,成功构建了pcDNA3.1-Annexin A7表达载体。该载体转染Hca-P细胞细胞后,经含有400ug/ml G418的完全培养基筛选,获得了稳定转染pcDNA3.1-Annexin A7表达载体的Hca-P细胞株。基因和蛋白质水平的检测表明:Annexin A7在该细胞显著上调表达。②利用pSilencer? 3.1-H1 neo质粒和shRNA成功构建了pSilencer 3.1-shRNA表达载体,该载体转染Hca-F细胞细胞后,经含有400ug/ml G418的完全培养基筛选,获得了稳定转染pSilencer 3.1-shRNA表达载体的Hca-F细胞株,基因和蛋白质水平的检测表明:Annexin A7在该细胞显著下调表达。③Annexin A7作为小鼠肝癌Hca-F和Hca-P细胞株的差异表达蛋白质,其高表达能促进肿瘤细胞分裂增殖,抑制肿瘤细胞凋亡,增强肿瘤细胞的迁移能力和侵袭能力。降低其表达水平可抑制小鼠肝癌细胞的分裂增殖,促进凋亡,降低小鼠肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力。提示Annexin A7是决定Hca-F淋巴道转移潜能的关键基因之一,可作为肝癌治疗中的一个备选的靶点。
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