漆酶在染料脱色和疏水性芳香化合物降解转化中的应用研究

论文摘要

环境问题是人类21世纪所面临的几个重大问题之一,环境保护也因此成为许多科技工作者竞相研究的课题。随着生物科学和生物工程的迅速发展,生物技术在环境保护领域逐渐展示了巨大威力,酶在环境保护方面的应用已呈现出良好的发展前景。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,它能够催化大量的酚类和芳香胺类化合物的氧化,在小分子介体存在下,其氧化底物的范围还可进一步扩大。由于漆酶作用底物广,因此它在废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、环境监测等方面具有重要的应用价值。漆酶的酶学性质与其来源有关,本文研究了Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料脱色反应的动力学,考察了反应介质条件和添加剂对脱色效果的影响,并利用响应面法研究了Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料RB亮蓝（RBBR）脱色过程中多参数之间的交互作用。本文还考察了不同类型表面活性剂（阳离子型、阴离子型和非离子型）和聚乙二醇（PEG）对漆酶酶学性质影响以及非离子表面活性剂Triton X-100对漆酶催化转化疏水性芳香化合物双酚A（BPA）的影响及机制,研究了不同类型表面活性剂组成的反胶束体系中漆酶的催化性能,探讨了PEG400对AOT/异辛烷/水反胶束中漆酶催化BPA降解转化的影响及其相应机制,为进一步研究漆酶在反胶束中催化转化芳香化合物提供了理论基础。一、Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料废水脱色来源不同的漆酶对染料废水降解和脱色的能力不同,其最佳反应条件也不同。由于介体价格较贵,因此寻求无介体的漆酶催化染料脱色体系可以有效地降低染料废水的处理成本。Irpex lacteus dft-1漆酶是一种新型漆酶。本文选用了三种不同类型的染料,研究了在不加介体的情况下Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料脱色反应的动力学,考察了反应介质条件和添加剂（非离子表面活性剂）对脱色效果的影响。研究表明,Irpex lacteus dft-1漆酶可以在不加介体的情况下对蒽醌染料茜素红、偶氮染料甲基红和三芳基甲烷染料溴甲酚绿较好地脱色。染料结构不同,脱色效果不同,而且最佳脱色pH也不同。当加入Triton X-100和Brij30后,由于低浓度下它们对漆酶有激活作用和稳定化作用,染料脱色率有所提高。响应面方法（RSM）运用了数学和统计学方法,可以用来建立模型、分析多变量间的交互影响作用,目前已经被应用于许多化学和生化过程的最佳化和评估独立变量间的交互影响。本文通过Box-Behnken设计研究了Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料RB亮蓝（RBBR）脱色反应中不同参数（温度、pH、酶浓度和反应时间）之间的交互作用,得到了漆酶催化染料RBBR脱色的二次模型。高F值（2279.28）和低P值（＜0.0001）表明该模型是显著的。结果表明,酶浓度是影响染料脱色过程的关键因素,pH与温度的交互作用最为显著。参数与响应间的高R2值（0.9996）表明响应面二次模型在本研究中较为适用。二、添加剂对水溶液中漆酶催化性能的影响研究在不同类型的表面活性剂组成的反胶束体系中,酶表现出的催化性能不同。这与反胶束体系的界面性质有关。聚乙二醇（PEG）是一种合成聚合物,能够溶解于水中,在漆酶转化酚类污染物时,能够明显提高酚类物质的转化率。为了阐明不同反胶束中漆酶催化性能的差异和PEG对漆酶催化性能的影响,我们选定了三种不同的表面活性剂（阳离子CTAB,阴离子AOT和非离子Triton X-100）和PEG,考察了其对漆酶酶学性质的影响。研究表明,它们在不同浓度下对漆酶活性的影响不同。PEG对漆酶活性没有影响。非离子表面活性剂Triton X-100在低浓度下对漆酶略有激活作用,而阳离子表面活性剂CTAB和阴离子表面活性剂AOT均抑制漆酶活性。当表面活性剂浓度较高时,三种表面活性剂均使酶活性降低。PEG对漆酶的最佳反应pH没有影响。CTAB和AOT使漆酶的最佳pH略向低pH值方向移动,而Triton X-100则使其向高pH值方向移动。Triton X-100和PEG没有引起漆酶最佳反应温度的变化,而加入CTAB和AOT后,最佳反应温度值降低。在水溶液中加入Triton X-100和PEG有利于漆酶的热稳定性提高,而CTAB和AOT使漆酶热稳定性降低。在非离子表面活性剂TritonX-100存在下,漆酶催化疏水性芳香化合物双酚A（BPA）转化反应的研究表明,TritonX-100可以明显提高BPA的转化率,特别是在TritonX-100的临界胶束浓度（CMC）附近。研究还发现,TritonX-100的存在可以提高反应体系中漆酶的稳定性。荧光发射光谱研究表明,漆酶与TritonX-100间存在着相互作用,且这种相互作用有利于漆酶的折叠并使之稳定化。束缚在漆酶表面的TritonX-100避免了反应过程中生成的中间体自由基和聚合产物对漆酶的失活作用。通过研究不同酶浓度和不同底物浓度下BPA的转化,我们发现若要达到相同的转化率,加入TritonX-100后可以明显降低漆酶的使用量。三、Irpex lacteus dft-1漆酶在反胶束中的催化性能研究对酶工程而言,除了要求酶活性较高外,还要求酶在反应体系中有较高的稳定性。有关漆酶在反胶束体系中稳定性的研究似乎较少,特别是关于各影响因素对其稳定性的影响还未有报道。本文重点考察了不同参数,即W0、缓冲液的种类、pH和离子强度、AOT浓度和温度等对Irpex lacteus dft-1漆酶在AOT/异辛烷/水反胶束中的活性和稳定性的影响。结果表明,Irpex lacteus dft-1漆酶活性随W0的增大而提高。当W0大于35时,其活性不再有明显的变化,而其稳定性在较小的W0下较好。酶的最佳反应pH为4.2,但其稳定性随pH的升高而增强。酶的活性和稳定性均随AOT浓度的提高而下降。不同的缓冲介质,酶的活性与稳定性不同,酶活性随缓冲液离子强度的提高先升高而后下降,而酶在较小的离子强度下具有较好的稳定性。酶最佳反应温度为50℃,但稳定性随温度升高而下降。Irpex lacteus dft-1漆酶在CTAB/正己醇/异辛烷/水反胶束和Triton X-100/正己醇/异辛烷/水反胶束体系中的活性明显低于AOT/异辛烷/水反胶束中的活性,且三种反胶束体系中漆酶的活性随W0的变化趋势不同。另外,在CTAB和TritonX-100反胶束中漆酶的最佳反应pH和温度均分别为4.2和50℃,这与AOT反胶束体系中一致。另外,漆酶活性和稳定性均随表面活性剂浓度的提高而下降。助剂正己醇在较低浓度下对酶活性影响不大,但随着正己醇的浓度继续提高,酶活性明显下降。总体来说,酶的稳定性在CTAB反胶束中最佳,Triton X-100次之,而在AOT反胶束体系中酶活性在初始阶段下降最快。Irpex lacteus dft-1漆酶在AOT/异辛烷/水反胶束内可以有效地催化转化BPA,加入适量PEG400后能明显提高BPA的转化速率。通过考察W0、缓冲液pH和离子强度以及表面活性剂AOT浓度等多个参数对BPA的转化速率的影响,发现加入PEG400后,BPA在AOT/异辛烷/水反胶束体系中的转化速率得到了提高。PEG400是水溶性大分子,可以溶入反胶束的水池中,在胶束界面包埋电荷从而减小酶与AOT头基的电性相互作用,而且PEG400可以与漆酶非共价结合,从而提高了漆酶在AOT/异辛烷/水反胶束内的活性和稳定性,进而提高了BPA的转化速率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩写
• 第一章 绪论
• 1.1 漆酶
• 1.1.1 漆酶的基本结构和活性中心
• 1.1.2 漆酶的催化氧化反应机理
• 1.1.3 漆酶在环境保护中的应用
• 1.2 胶束酶学
• 1.2.1 表面活性剂水溶液中的酶反应
• 1.2.2 反胶束酶学研究
• 1.3 本论文的立题依据和研究内容
• 1.3.1 立题依据
• 1.3.2 研究内容
• 参考文献
• 第二章 Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料废水脱色
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 仪器与试剂
• 2.1.2 Irpex lacteus dft-1漆酶的生产
• 2.1.3 Irpex lacteus dft-1漆酶的纯化
• 2.1.4 漆酶活性检测
• 2.1.5 染料脱色实验
• 2.1.6 脱色反应动力学研究
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 漆酶的纯化
• 2.2.2 酶催化染料脱色
• 2.2.3 pH的影响
• 2.2.4 温度的影响
• 2.2.5 初始酶浓度的影响
• 2.2.6 动力学研究
• 2.2.7 非离子表面活性剂对漆酶脱色染料的影响
• 2.3 结论
• 参考文献
• 第三章 响应面法研究Irpex lacteus dft-1漆酶催化RBBR脱色反应中参数的交互作用
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 仪器与试剂
• 3.1.2 酶活性检验
• 3.1.3 响应面方法
• 3.1.4 染料脱色实验
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 Irpex lacteus dft-1漆酶催化RBBR脱色
• 3.2.2 响应面研究
• 3.2.3 模型适合度检验
• 3.3 结论
• 参考文献
• 第四章 添加剂对水溶液中漆酶催化性能的影响研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 仪器与试剂
• 4.1.2 漆酶活性检验
• 4.1.3 表面活性剂和PEG浓度对漆酶活性的影响
• m和V_max的测定'>4.1.4 K_m和V_max的测定
• 4.1.5 最佳pH和温度实验
• 4.1.6 热稳定性检测
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 表面活性剂和PEG浓度对漆酶活性的影响
• 4.2.2 表面活性剂和PEG对漆酶最佳pH和温度的影响
• 4.2.3 不同表面活性剂和PEG对酶稳定性的影响
• 4.3 结论
• 参考文献
• 第五章 非离子表面活性剂Triton X-100对漆酶转化双酚A的影响及机理研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 仪器与试剂
• 5.1.2 酶活性检验
• 5.1.3 表面张力的测定
• 5.1.4 荧光光谱的测定
• 5.1.5 双酚A转化的测定
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 表面活性剂浓度对转化率的影响
• 5.2.2 TritonX-100的影响机理
• 5.2.3 酶量与底物浓度的影响
• 5.3 结论
• 参考文献
• 第六章 Irpex lacteus dft-1漆酶在反胶束中的催化性能研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 仪器与试剂
• 6.1.2 含酶反胶束的配制方法
• 6.1.3 漆酶活性和稳定性的检验
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 AOT/异辛烷/水反胶束中酶的催化性能
• 6.2.2 CTAB/正己醇/异辛烷/水反胶束中酶的催化性能
• 6.2.3 Triton X-100/正己醇/异辛烷/水反胶束中酶的催化性能
• 6.2.4 不同类型反胶束中酶的催化性能比较
• 6.3 结论
• 参考文献
• 第七章 PEG400对AOT/异辛烷/水反胶束中Irpex lacteus dft-1漆酶转化双酚A的影响研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 仪器与试剂
• 7.1.2 酶活性检测
• 7.1.3 反胶束的配制
• 7.1.4 BPA浓度分析
• 7.1.5 反胶束中酶的稳定性分析
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 AOT/异辛烷/水反胶束中BPA的转化
• 7.2.2 PEG400浓度的影响
• 0的影响'>7.2.3 W₀的影响
• 7.2.4 pH的影响
• 7.2.5 表面活性剂浓度的影响
• 7.2.6 离子强度的影响
• 7.2.7 PEG400对漆酶在AOT/异辛烷/水反胶束中稳定性的影响
• 7.3 结论
• 参考文献
• 第八章 结论与建议
• 8.1 结论
• 8.2 建议
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表学术论文
• 附录1 Effects of nonionic surfactant Triton X-100 on the laccase-catalyzed conversion of bisphenol A
• 附录2 Response surface methodology for the evaluation of effects of various parameters and their interactions on the decolorization of Remazol Brilliant Blue R by laccase from Irpex lacteus dft-1
• 学位论文评阅及答辩情况表