中国人参（Panax ginseng C.A.Meyer）野生和栽培类型的遗传多样性和DNA甲基化多态性研究

论文摘要

人参是重要的药用植物,被称为“百草之王”。在野生人参与栽培人参之间巨大的价格差异的商业利益驱使下,人们对野生人参资源进行过度开采,以至于野生人参已经处于灭绝的边缘,现在已经不得不通过栽培来满足野生人参市场的需要。众所周知,对于植物物种的栽培驯化会导致其遗传多样性的大量丢失。为了了解野生和栽培人参类型之间遗传多样性的差异,我们开展了本文研究工作。然而,关于人参野生型和栽培型的遗传和表观遗传差异依然处于未知阶段,为解决此问题,我们首先选择中国人参(Panax ginseng)野生和栽培两个类群中的17个单株,西洋参的4个单株和一个五加科外群种(短梗五加Acanthopanax sessiliflorus)的1个单株。利用筛选的24对引物,进行了扩增片段长度多态性(AFLP)分析,共产生了1490个位点(平均每对引物62个位点),其中有1342个位点在22个单株中呈现多态性,多态性水平为90.06%。UPGMA聚类分析显示,在所有研究的人参单株中,只有西洋参形成一个单独的分组,野生型和栽培型没有形成明确的分组。在随后的分析中也证明了这一点:PCOORDA分析显示了相同的分组情况。我们发现西洋参与人参的几个亚组之间存在着很高水平的的遗传差异,范围在0.3699 (AMG vs. WLG)到0.4715 (AMG vs. CHB)之间。在栽培和野生型(WLG and WDM)人参中只发现了较低水平的遗传差异,除了“长脖”和“石柱”之外其他的都几乎具有相同的差异趋势。另外,这两个组(野生和栽培人参)之间遗传差异的相关系数很低(0.2057),说明只有25.57%的遗传差异属于两个组之间的,79.43%的遗传差异都属于这两个组之中单株之间的差异。AMOVA分析显示遗传多样性的大部分(91.64%; P <0.001)存在于组内(野生/栽培),而只有8.36% (P >0.001)的遗传多样性存在于两个组之间。我们进一步进行了甲基化敏感多态性分析(MSAP),通过筛选的28对引物进行扩增,总共生成1821个清晰可重复的位点,其中有379个(20.81%)是甲基化的位点,79.19%是非甲基化位点。甲基化不敏感多态性(MISP)分析的结果与AFLP分析结果相一致。结合AFLP和MIP结果分析显示,人参野生和栽培群体之间遗传距离非常近。与遗传多态性相反的是,甲基化敏感多态性(MSP)结果显示出不同的单株形成明显的分组,除了天然野生型(WLG)和栽培野生型(WDM)之外,每个亚组都能够单独聚类,前者仍然聚类成一组。PCOORDA分析显示出相同的分组结果确证了前述结论。同时在CG和CNG位点甲基化水平上野生型和一些栽培型中发现了明显的差异,“长脖”和“石柱”的甲基化水平最低,只有野生型组群(WLG或WDM)的三分之一左右。进一步AMOVA分析显示组间DNA甲基化多样性要比AFLP和MIP方法高(分别为8.36%和9.17%)。两组之间相关性分析,例如野生和栽培人参,显示了表观遗传差异在平均水平上高于遗传差异。这表明人参的驯化过程在全基因组水平上诱导产生了大量甲基化多态性。最后,通过亚硫酸盐测序对甲基化敏感多态性结果进行验证,结果显示栽培型(特别是“长脖”和“石柱”)中的甲基化水平较低,野生型人参的甲基化水平较高。基于Jaccard相似性相关系数的Mantel分析显示,在所研究的单株中,遗传和表观遗传多态性没有显著相关性,这进一步说明在人参驯化过程中,DNA甲基化水平和模式受到了较大的影响。将两个亚组之间呈现遗传和甲基化差异的条带回收测序并进行同源性分析,结果显示,有部分条带序列与已知功能或推测蛋白编码基因同源,然而很少甚至没有与重复序列如转座子和反转座子同源的序列。这暗示,这些野生和栽培人参中发生的表观遗传变异的序列可能影响了基因的差异表达。

论文目录

• Abstract
• 摘要
• General introduction
• 1.1 Background on Panax ginseng
• 1.1.1 Etymology, botanical position, and history of Panax ginseng
• 1.1.2 Classifications of Panax
• 1.1.3 Reproductive system, growth, and cultivation of ginseng
• 1.2. Importance of Panax ginseng
• 1.2.1 Medicinal importance of Panax ginseng
• 1.2.2 Bioactive compounds of Panax ginseng C.A. Meyer
• 1.2.3 Economic importance of ginseng
• 1.3 Genomic analyses of ginseng
• 1.4 Genetic diversity among and between plant populations
• 1.5 DNA methylation polymorphisms among and between plant populations
• 1.6 Aims and scope of the present work
• Materials and Methods
• 2.1 Plant material
• 2.2 Methods
• 2.2.1 Total genomic DNA extraction and purification
• 2.2.2 AFLP analysis
• 2.2.3 MSAP analysis
• 2.2.4 Band scoring and statistical data analysis
• 2.2.5 Isolation, cloning, and sequencing of AFLP and MSAP variable bands
• 2.2.6 Bisulfite conversion and sequencing
• Results analysis
• 3.1 AFLP polymorphisms
• 3.1.1 AFLP-based genetic structure of ginseng groups
• 3.2 MSAP analysis
• 3.2.1 Methylation levels in the studied groups of ginseng plants
• 3.2.2 Methylation-insensitive polymorphisms
• 3.2.3 MIP-based genetic structure of ginseng groups
• 3.2.4 Methylation-sensitive polymorphisms （MSP）
• 3.2.5 Epigenetic structure of ginseng groups
• 3.3 Summary of the indices of genetic and epigenetic diversity between wild and cultivated ginseng
• 3.4 Mantel test for correlations between genetic and epigenetic polymorphisms
• 3.5 Sequences of the AFLP and MSAP variants indicative of genetic and epigenetic polymorphisms
• 3.6 Validation of cytosine methylation alteration by bisulfite sequencing
• Discussion
• 4.1 Absence of clear genetic difference between wild and cultivated ginseng plants
• 4.2 Epigenetic distinctness between wild and cultivated ginseng plants
• Conclusions
• References
• Acknowledgements
• List of Publications