毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因克隆研究

论文摘要

基因控制技术是森林有害生物可持续控制策略实现的技术体系之一,发现自主产权的功能基因资源可以为我国森林保护工作者更好地利用这一控制技术打下良好的基础。巯基蛋白酶抑制剂（cysteine proteinase inhibitor（cystatin）,CPI）是一类广泛存在于动植物和微生物体内的蛋白超家族。根据它的蛋白特性植物CPI已经被归入一个新的CPI家族（Phytocystatin）。由于CPI可以通过抑制昆虫中肠中作为消化酶的巯基蛋白水解酶作用达到杀虫目的,它作为一种重要的抗虫因子已经被广泛用于转基因工程。本研究主要在毛白杨CPI基因的克隆、测序、鉴定以及其基因序列分析方面开展了一些工作。取得的初步成果有: 1.根据生物信息学相关原理,通过分析软件,获得毛白杨CPI的氨基酸保守序列区段,根据此保守区段首先设计合成了用于CPI保守序列区段扩增的正向及反向简并引物,通过对毛白杨形成层RNA的特异RT-PCR扩增,获得大小为165bp的单一片段条带,鉴定为毛白杨CPI基因的保守序列区段。 2.利用RT-PCR技术从毛白杨形成层提取的RNA中扩增出一个大小为696bp的的单一片段条带。将其克隆到pGEM-T Easy载体上,获得了重组质粒。通过对该重组质粒进行PCR扩增鉴定以及序列测序分析,证明插入到载体上的片段即是毛白杨CPI基因cDNA序列片段,包含完整的开放阅读框（ORF）。 3.通过相同的引物利用PCR技术从毛白杨形成层提取的基因组DNA中扩增出一个大小为1950bp的单一片段条带,将其克隆到pGEM-T Easy载体上,通过对该重组质粒进行了PCR扩增以及测序分析,证明插入到载体上的片段即是毛白杨CPI基因DNA片段。通过和毛白杨CPI基因cDNA片段的比较进行基因分析,获得基因编码区中内含子和外显子具体定位。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 2 植物巯基蛋白酶抑制剂的研究进展
• 2.1 植物巯基蛋白酶抑制剂的发现和分布
• 2.2 植物CPI的结构特点
• 2.2.1 植物CPI一级结构特点
• 2.2.2 根据一级结构的植物CPl分类
• 2.2.3 植物CPI二级结构及其功能关系
• 2.3 植物CPI的生理功能
• 2.4 植物CPI基因的克隆及其在基因工程中的应用
• 2.4.1 植物CPI基因克隆方面的研究进展
• 2.4.2 植物CPI基因在基因工程中的应用
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 实验用品
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 生物信息学方法分析植物CPI序列特征
• 3.2.2 毛白杨CPI基因保守序列区段的克隆，鉴定
• 3.2.3 毛白杨CPI基因cDNA编码区的克隆鉴定
• 3.2.4 毛白杨CPI基因DNA的克隆，鉴定
• 3.2.5 序列比较分析基因结构
• 4 结果与分析
• 4.1 毛白杨CPI基因保守序列区段的克隆
• 4.1.1 毛白杨形成层总RNA的提取和质量鉴定
• 4.1.2 毛白杨CPI基因cDNA保守序列区段的克隆，测序
• 4.2 毛白杨CPI基因cDNA编码区段的克隆
• 4.2.1 毛白杨CPI基因cDNA编码区段的拼接预测
• 4.2.2 毛白杨CPI基因cDNA编码区段的克隆，重组和测序
• 4.2.3 毛白杨CPI基因cDNA编码区段的序列分析
• 4.3 毛白杨CPI基因分析
• 4.3.1 毛白杨基因组DNA的提取和质量鉴定
• 4.3.2 毛白杨CPI基因DNA编码区段的DNA克隆，重组和测序
• 4.3.3 毛白杨CPI基因结构分析
• 5 讨论
• 5.1 高效少量毛白杨形成层RNA提取方法
• 5.2 简单快速克隆新基因方法的确立
• 6 结论与建议
• 6.1 结论
• 6.2 建议
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢