拟南芥CRY1基因C末端导入甘蓝型油菜的遗传表达及卡那霉素抗性筛选方法研究

论文摘要

四川农业大学油菜研究中心从2003年起，利用floral-dip转基因方法对甘蓝型油菜（B.napus L.）westar及白菜型油菜（B.campestris L.）雅安黄油菜（雅黄）进行遗传转化，获得了一批具有卡那霉素（Km）抗性的种子，本研究对这批种子进行了遗传、表达鉴定及Km抗性筛选方法的研究，主要结果如下：1．对转基因甘蓝型油菜westar后代T2代株系，通过Km抗性鉴定，结合PCR检测及序列比对验证，对拟南芥CRY1基因C末端导入甘蓝型油菜后的遗传表现进行了分析；并利用GUS染色和花色素苷积累量的比较，对CRY1基因C末端在转基因甘蓝型油菜中的表达进行了研究。结果表明，转化的外源目的基因多数以嵌合形式，少数以单拷贝形式整合到转基因甘蓝型油菜的基因组中；目的基因能稳定地遗传给后代，株系间遗传传递率为62.5％；T2代的遗传行为少数呈现孟德尔遗传，多数呈现非孟德尔遗传现象；拟南芥CRY1基因能在转基因油菜中表达，但也出现了沉默现象。2．对转基因甘蓝型油菜westar后代T3代种子，利用近红外检测仪对种子的含油量、芥酸含量、硫苷含量等品质性状进行检测，方差分析结果表明，转基因油菜种子在含油量、芥酸含量、硫苷含量等品质性状上与非转基因油菜没有显著差异。3．对雅安黄油菜T0代种子，利用Km叶片涂抹法、种子浸泡法以及MS培养基法对含有NPT-Ⅱ标记基因的T0代种子进行筛选。结果表明，三种筛选方法的最佳Km选择压都为200mg／L；涂抹叶片法4-5d可以明显识别植株对Km抗性与否，此法筛选到的4株植株PCR检测全部呈阳性，可靠性达100％；浸泡种子法2-3d可从长出子叶是否是绿色明显识别植株对Km抗性与否，此法筛选到的5株植株PCR检测全部呈阳性，可靠性100％；MS培养基筛选法一般10-15aN以明显植株识别对Km抗性与否，此法筛选到20株植株，移栽后存活5株，PCR检测3株呈阳性，2株是假阳性植株，可靠性为60％。因此可以认为叶片涂抹和种子浸泡两种方法是油菜转基因进行大规模、快速的筛选及后代遗传分析的理想方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 植物转基因技术
• 2 转基因技术
• 2.1 基因工程在油菜中的应用
• 2.2 油菜转基因存在的问题
• 3 农杆菌介导floral-dip转基因技术
• 3.1 农杆菌介导floral-dip法的提出及发展
• 3.2 农杆菌介导floral-dip法的优点
• 4 转基因后代的遗传、表达与沉默
• 4.1 转基因后代的遗传
• 4.2 转基因后代的表达
• 4.3 转基因的沉默
• 5 基因后代的检测
• 5.1 选择标记基因与报告基因检测
• 5.2 PCR检测
• 5.3 Southern杂交与电子杂交
• 6 拟南芥CRY1基因的结构及功能
• 6.1 拟南芥CRY1基因的结构
• 6.2 拟南芥CRY1基因的功能
• 7 本研究的目的与意义
• 7.1 本研究的目的
• 7.2 本研究的意义
• 第二部分 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 油菜材料
• 1.2 菌株及目的基因
• 1.3 主要生化试剂
• 1.4 培养基配方
• 1.5 主要仪器设备
• 2 方法
• 2代的Km抗性鉴定'>2.1 转基因甘蓝型油菜T₂代的Km抗性鉴定
• 2.1.1 Km最佳致死浓度的确定
• 2代Km抗性鉴定'>2.1.2 甘蓝型油菜T₂代Km抗性鉴定
• 2.2 转基因植株的PCR检测
• 2.2.1 油菜总DNA的提取及DNA纯度检测与浓度估算
• 2.2.2 引物设计与合成
• 2.2.3 PCR反应体系及条件的优化
• 2.2.4 转基因植株的PCR检测及琼脂糖电泳
• 2.3 目的片段的回收、克隆测序和序列比对
• 5A)感受态细胞的制备'>2.3.1 大肠杆菌(DH_5A)感受态细胞的制备
• 2.3.2 目的片段的纯化回收及连接
• 2.3.3 转化
• 2.3.4 克隆测序与序列比对
• 2.4 GUS报告基因的组织化学活性检测
• 2.5 转化植株的花色素苷提取
• 2.6 转基因油菜品质变异检测
• 2.7 Km抗性筛选方法的比较
• 2.7.1 叶片涂抹法
• 2.7.1.1 Km最佳致死浓度的确定
• 2.7.1.2 抗Km植株的筛选
• 2.7.2 种子浸泡法
• 2.7.2.1 Km最佳致死浓度的确定
• 2.7.2.2 抗Km植株的筛选
• 2.7.3 MS培养基筛选法
• 2.7.3.1 Km最佳致死浓度的确定
• 2.7.3.2 抗Km植株的筛选
• 2.7.4 抗性植株的PCR检测
• 第三部分 结果分析
• 1 Km最佳致死浓度的确定
• 2代Km抗性分离结果'>2 转基因T₂代Km抗性分离结果
• 3 转基因植株的PCR检测及序列比对
• 3.1 引物设计与合成结果
• 3.2 PCR反应体系及条件优化
• 3.4 目的条带回收、克隆测序及序列比对
• 4 GUS组织化学检测
• 5 花色素苷积累量的比较
• 3代与非转基因品质比较'>6 转基因油菜T₃代与非转基因品质比较
• 7 Km筛选方法的比较
• 7.1 叶片涂抹法
• 7.1.1 Km最佳致死浓度的确定
• 0代种子的Km筛选结果'>7.1.2 雅黄T₀代种子的Km筛选结果
• 7.2 种子浸泡法
• 7.2.1 Km最佳致死浓度的确定
• 0代种子的Km筛选结果'>7.2.2 雅黄T₀代种子的Km筛选结果
• 7.3 MS培养基筛选法
• 7.3.1 Km最佳致死浓度的确定
• 0代种子的Km筛选结果'>7.3.2 雅黄T₀代种子的Km筛选结果
• 第四部分 讨论
• 1 拟南芥CRY1基因导入甘蓝型油菜后的遗传方式及表达
• 1.1 拟南芥CRY1基因导入甘蓝型油菜的遗传方式
• 1.2 拟南芥CRY1导入甘蓝型油菜的表达
• 2 转基因油菜的分子检测
• 3代与非转基因油菜品质的比较'>3 转基因油菜T₃代与非转基因油菜品质的比较
• 4 Km抗性筛选方法的比较
• 4.1 叶片涂抹法
• 4.2 种子浸泡法
• 4.3 MS培养基法
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间发表的文章