外周血单个核细胞NADPH氧化酶活性及表达与中老年男性颈动脉硬化的关系

论文摘要

背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的氧化学说认为血管壁中氧化的低密度脂蛋白（oxidized low density protein,ox-LDL）在AS的发生发展中起到非常关键的作用,ox-LDL促进动脉粥样硬化病变的形成。它可以摄取巨噬细胞、促进粘附分子的表达并促进平滑肌细胞的增殖。它本身还可以作为氧化因子诱导氧化应激（oxidative stress）来损伤血管平滑肌细胞和内皮细胞。氧化应激在高血压、糖尿病、高脂血症等引起的动脉粥样硬化的发病机制中起重要作用,大量证据表明氧化应激明确的与内皮功能的紊乱以及动脉粥样硬化相关。活性氧（reactive oxygen species ,ROS）可通过多种途径来促进AS的形成,其中一方面就是诱导应激反应来改变细胞的功能,包括粘附、增殖和活力。另一方面,它还可以直接发挥细胞毒性作用,并能通过细胞信号系统调控有关基因表达。体内有多种酶参与了活性氧的生成,研究表明NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH oxidase）氧化酶目前被认为是血管内生成活性氧的主要酶体。由活化的NADPH氧化酶生成的过多的ROS能氧化蛋白质、脂类和DNA来导致氧化应激和其他病理改变。单核细胞浸入血管壁是AS的一个关键步骤,它可以介导LDL的氧化及细胞的粘附和增殖,且血标本较血管标本易获得,因而研究人外周血单核细胞（human peripheral blood mononuclear cells ）NADPH氧化酶的表达来反映AS的程度有着十分重要的意义。研究显示,NOX2是NADPH氧化酶的催化核心,而p47phox对调节NADPH氧化酶活性起到重要作用,因此我们选择用NOX2的表达及p47phox的活化来反映酶的活性。大量的观察表明,内源性雄性激素水平与男性AS程度呈负相关,氧化应激是AS的重要机制之一,但是雄性激素的变化与氧化应激关系尚未阐明。目的探讨中老年男性颈动脉硬化程度与氧化应激及NADPH氧化酶的关系,并了解中老年男性性激素水平与NADPH氧化酶的相关性。方法1、RT-PCR检测人外周血单个核细胞中NOX基因的表达以及NOX各亚单位的表达;2、应用流式细胞仪测定外周血单个核细胞在高浓度LDL刺激下产生的ROS,并给予各种氧化酶抑制剂后测定ROS;3、选择32例颈动脉内膜增厚病人为病例组,28例健康人为对照组。两组均空腹抽血测定生化指标,放免法测定性激素,结果应用t检验进行分析;4、检测血清中丙二醛（malondialdehyde,MDA）,蛋白羰基化水平来对颈动脉硬化患者和正常对照者机体氧化应激状态进行全面检测;5、Realtime-PCR及Western blot方法比较颈动脉硬化患者和正常对照者单个核细胞中NOX2的表达;6、间接免疫荧光的方法对p47phox的定位情况进行检测,比较颈动脉硬化患者和正常对照者NADPH氧化酶的活性。用SPSS11.0软件对所检测的激素水平及生化指标,氧化应激指标和NADPH氧化酶的表达进行分析。数值变量两组间比较采用t-Student检验,NOX2和MDA与雌、雄激素水平之间的关系采用Pearson相关分析。结果1、颈动脉硬化组年龄、总胆固醇、高密度脂蛋白与对照组无显著性差异,睾酮、甘油三酯（TG）、LDL、Hs-CRP、尿酸和空腹血糖均高于正常对照组,p<0.05;2、颈动脉硬化组MDA为6.36±3.2（nmol/ml）,明显高于对照组4.95±2.63（nmol/ml）（p<0.05）;颈动脉硬化组血清蛋白羰基化水平明显高于正常组为正常组的1.64倍（P<0.05）;3、通过Realtime-PCR检测表明,与正常对照相比,颈动脉硬化组单个核细胞中NOX2表达明显增加,相对含量分别为1.89±0.76和1.49±0.59,p=0.038,有显著性差异。而其它亚组分p47phox,p22phox的表达无显著性差异。通过Western blot进一步证实了以上结果;4、在颈动脉硬化组患者中,p47phox高度活化,其活化率颈动脉硬化组为30.56%,对照组为18.70%,存在显著差异;5、NOX2和MDA的升高分别与睾酮水平负相关。结论1、较高的氧化应激状态是促进AS的重要途径之一。2、NADPH氧化酶通过增强NOX2的表达和p47phox的活化参与调节机体的氧化应激。3、中老年男性雄激素水平与AS程度和氧化应激状态有一定相关性。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言和文献回顾
• 前言
• 文献回顾
• 1.氧化应激与动脉硬化
• 2.NADPH 氧化酶与动脉硬化的研究进展
• 3.老年男性性激素与动脉硬化的研究进展
• 4.目前需要解决的问题和临床应用前景
• 正文
• 1 人外周血单个核细胞NADPH 氧化酶的组成及其与ROS 的关系
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 2 比较颈动脉硬化患者和正常对照者氧化应激状态及单（个）核细胞中NADPH 氧化酶的表达
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 附图
• 3 睾酮与人外周血单个核细胞NADPH 氧化酶的表达的关系
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 个人简介
• 语言
• 参加学术会议
• 硕士间发表的论文
• 致谢