论文摘要
背景:膀胱癌的基因治疗途径已显现研究前景。重组腺病毒目前用于基因治疗。目的基因在靶组织中的差异表达在基因治疗中很重要,一种方法是用组织特异性启动子驱动治疗基因表达。本研究是构建膀胱上皮特异性重组腺病毒,探讨其在膀胱癌细胞中的抑制作用。方法:RT-PCR分析用于鉴定几种细胞株中hUPII和柯萨奇腺病毒受体（CAR）的表达。瞬时转染和荧光素酶检测试验用于鉴定hUPII启动子的组织特异性。从RpS-TOAD-PSE-PBN-E1A载体酶切得到E1A片段。用引物从CP1131载体扩增得到hUPII启动子片段。E1A片段和hUPII启动子片段插入穿梭载体RpS-TOAD建立Rp-UPII-E1A载体。从Rp-UPII-E1A载体中切除E1A片段建立Rp-UPII-Null载体。Rp-UPII-E1A和Rp-UPII-Null分别与pAdEasy-1通过电穿孔共转染大肠杆菌BJ5183的电转化感受态细胞。阳性质粒转入大肠杆菌DH5α中用于大量扩增。两种阳性质粒Pac I酶切后通过Lipofectamine 2000转染293细胞。7天后收获病毒。病毒在293细胞中增殖到足够量后,用常规CsCl离心纯化腺病毒。用UV-SDS法和TCID50法测定病毒滴度。提取Ad-UPII-E1A和Ad-UPII-Null的病毒DNA,用特异于E1A基因和UPII启动子的引物的PCR证实。用重组腺病毒Ad-UPII-E1A和Ad-UPII-Null感染细胞48小时后,用Western blot检测E1A蛋白在BIU-87细胞中的表达。检测了重组腺病毒Ad-UPII-E1A在膀胱癌细胞株BIU-87中的抑制作用。结果:在膀胱癌细胞株BIU-87中表达hUPII和柯萨奇腺病毒受体（CAR）。在膀胱癌细胞株BIU-87中hUPII启动子活性高。用细菌中同源重组技术把hUPII启动子和E1A基因插入5型重组腺病毒基因组中。在Ad-UPII-E1A的病毒DNA中有E1A基因和UPII启动子,在Ad-UPII-Null的病毒DNA中仅有UPII启动子没有E1A基因。在重组腺病毒Ad-UPII-E1A感染的BIU-87细胞中E1A蛋白明显阳性。MTT试验表明重组腺病毒Ad-UPII-E1A抑制膀胱癌细胞BIU-87的生长。结论:hUPII启动子组织特异性高。构建和验证了重组腺病毒Ad-UPII-E1A和Ad-UPII-Null。在膀胱癌细胞株BIU-87中重组腺病毒Ad-UPII-E1A的抑制作用是显著的。
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