内源性PAI-1下调药物的筛选和药效评价

论文摘要

纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）是纤溶系统的重要因子,以其作为靶点研发的溶栓药物在国内外一直是抗血栓新药物研究的热点。目前开发的PAI-1药用前体都存在着半衰期短,安全剂量范围窄,价格昂贵等缺点。本文从中草药入手,筛选下调内源性PAI-1表达的天然药用植物,有望避免以上不足,成为研制新型抗血栓药物的有效途径。通过建立实时荧光定量RT-PCR方法,检测人微血管内皮细胞PAI-1mRNA的表达。采用SYBR Green I定量PCR,建立标准曲线。方法学考核参数为特异性、线性范围、精密度和重复性。定量方法特异性好,检测的灵敏度达103拷贝,线性范围为103～1010拷贝,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（R2 >0.990）,批内变异1.56%～4.79%,批间变异8.54%～10.23%。通过对药用植物库的初步筛选和重复筛选,得到了能够下调PAI-1表达的中药川芎和丹参。其中川芎可将PAI-1 mRNA表达下调至空白对照的1.11倍。采用不同的溶剂提取川芎,培养人微血管内皮细胞,ELISA法测定细胞培养上清中组织纤溶酶原激活物（t-PA）和PAI-1的抗原含量,CSA法测定细胞培养上清中t-PA和PAI-1的活性,实时荧光定量RT-PCR法测定细胞培养上清中t-PA和PAI-1的mRNA表达。结果,川芎醇提物可明显提高t-PA的抗原含量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 PAI-1 概述
• 1.2.1 PAI-1 的生理学特性
• 1.2.2 PAI-1 的作用
• 1.2.2.1 参与调节体内凝血和纤溶的平衡
• 1.2.2.2 稳定基底膜
• 1.2.2.3 其它作用
• 1.2.3 PAI-1 与血管类疾病
• 1.2.3.1 PAI-1 与脑血管疾病
• 1.2.3.2 PAI-1 与心血管疾病
• 1.2.4 PAI-1 的检测方法
• 1.2.4.1 PAI-1 的活性检测（PAI-1 :A,CSA 法）
• 1.2.4.2 PAI-1 的抗原检测（PAI-1 :Ag,ELISA 法）
• 1.2.4.3 PAI-1 的基因检测（RT-PCR 法）
• 1.3 立题意义
• 1.4 研究内容
• 第二章 血管内皮细胞PAI-1 基因检测方法的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要溶液
• 2.2.4 实验细胞株
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 HMEC-1 细胞的培养
• 2.3.2 总RNA 提取与逆转录反应
• 2.3.2.1 总RNA 提取
• 2.3.2.2 逆转录反应
• 2.3.3 PAI-1 和β-actin 引物设计
• 2.3.4 标准品的准备
• 2.3.4.1 PAI-1 和β-actin 的普通PCR
• 2.3.4.2 PCR 产物的电泳与纯化
• 2.3.5 实时荧光定量PCR
• 2.3.5.1 PAI-1 和β-actin 标准曲线的建立
• 2.3.5.2 灵敏度、特异性、重复性试验
• 2.3.6 统计学方法
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 总RNA 提取结果
• 2.4.2 PAI-1 和β-actin 标准品的制备
• 2.4.3 PAI-1 和β-actin 的标准曲线
• 2.4.4 标准曲线的灵敏性和熔解曲线分析
• 2.4.5 重复性实验
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 第三章 PAI-1 下调药物的筛选
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 主要仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要溶液
• 3.2.4 培养基
• 3.2.5 实验细胞株
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 药物初筛
• 3.3.1.1 HMEC-1 细胞的培养
• 3.3.1.2 流式细胞仪分析细胞同步化条件
• 3.3.1.3 中药样品的配制
• 3.3.1.4 药物干预
• 3.3.1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测t-PA :Ag
• 3.3.2 对初筛药物进行PAI-1 指标考察
• 3.3.2.1 酶联免疫吸附试验（ELESA）检测PAI-1:Ag
• 3.3.2.2 发色免疫吸附试验（CSA） 检测PAI-1:A
• 3.3.2.3 内皮细胞PAI-1 基因表达的检测
• 3.3.3 统计学方法
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 流式细胞仪分析细胞同步化条件
• 3.4.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测t-PA :Ag
• 3.4.2.1 标准曲线的绘制
• 3.4.2.2 初筛结果
• 3.4.3 酶联免疫吸附试验（ELESA）检测PAI-1:Ag
• 3.4.3.1 标准曲线的绘制
• 3.4.3.2 复筛中药对PAI-1:Ag 的影响
• 3.4.4 发色免疫吸附试验（CSA） 检测PAI-1:A
• 3.4.4.1 标准曲线的绘制
• 3.4.4.2 复筛中药对PAI-1:A 的影响
• 3.4.5 内皮细胞PAI-1 基因表达的检测
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 第四章 川芎提取物对血管内皮细胞 t-PA 和 PAI-1 的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 实验细胞株
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 川芎不同提取物的获得
• 4.3.2 HMEC-1 细胞的培养
• 4.3.3 川芎对HMEC-1 细胞的干预
• 4.3.4 发色底物法检测细胞上清中t-PA、PAI-1 的活性
• 4.3.5 用酶联免疫吸附法检测细胞上清中t-PA、PAI-1 的抗原含量
• 4.3.6 荧光定量RT-PCR 检测细胞上清中t-PA、PAI-1 m RNA 表达
• 4.3.6.1 荧光定量RT-PCR 检测细胞上清中t-PA mRNA 的方法
• 4.3.6.2 荧光定量RT-PCR 检测细胞上清中PAI-1 mRNA 的方法
• 4.3.7 统计学方法
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 川芎对HMEC-1 细胞t-PA、PAI-1 活性的影响
• 4.4.2 川芎对HMEC-1 细胞t-PA、PAI-1 抗原含量的影响
• 4.4.3 川芎对HMEC-1 细胞t-PA、PAI-1 mRNA 的影响
• 4.4.3.1 川芎对HMEC-1 细胞t-PA mRNA 的影响
• 4.4.3.2 川芎对HMEC-1 细胞PAI-1 m RNA 的影响
• 4.5 讨论
• 4.6 小结
• 第五章 总结与展望
• 课题总结
• 课题展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文