类骨结构胶原纤维基多孔磷酸三钙/胶原复合材料的制备及其生物学评价

论文摘要

骨缺损、骨不连的修复,一直是骨科领域的棘手问题,人们采用许多修复办法如自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植、金属材料、陶瓷及人工合成的高分子材料等来修复骨缺损,但是它们都有各自的缺陷。如供体来源有限、免疫排异反应、难以降解、有毒及其它副反应。近年来设计仿生骨基质材料,为解决骨缺损及骨不连修复提供了全新的修复办法,并已渗入到骨科各个领域,成为国内外研究的热点之一。仿生骨基质材料就是设计一种具有和天然骨基质类似的结构（结构仿生）和功能（功能仿生）的骨基质材料。这种仿生骨基质材料应在体内除了应有良好的生物活性和降解性,具有促进或加速骨组织修复的效能是当前生物材料研究的重点。本文基于自然骨的组元和微观结构,通过微观结构仿生与化学组元优化相结合,将纳米磷酸三钙（TCP）颗粒与骨胶原微纤维复合成为类骨结构胶原纤维,从而可有效地利用TCP良好的生物降解特性、形貌变化特性、载体功能和胶原良好的细胞/组织相容性以及两者的协同效应,期望构造出一种具有独特微/纳结构的新型骨修复/再生材料,并通过体内、外系列实验研究观察其理化性能、生物相容性及其诱导、传导成骨的能力,为骨组织高效重建创建良好的的初始平台。为此,本论文首先开展对复合材料的制备及其理化性能的系统研究和表征,然后进行了对类骨结构胶原纤维基复合材料的体外细胞相容性和生物活性研究,最后开展了类骨结构胶原纤维基复合材料对兔股骨骨缺损修复的体内实验研究,初步评价了它的骨修复能力。主要的研究内容如下:（1）经过酸性介质对胶原处理形成胶原微纤维,分别加入纳米TCP颗粒,在湿化学条件下制成类骨结构胶原纤维基多孔β-TCP/Col复合材料,应用扫描电镜观察复合材料的显微形貌、孔径,测量孔隙率,并浸泡于PBS缓冲液中观察β-TCP/Col复合材料的形貌变化。结果显示:酸性条件下,类骨结构胶原纤维构成的孔壁成网状;最佳酸性条件为pH=2;复合材料的孔径在100μm左右,孔隙率为90%以上。经过体外缓冲溶液的浸泡,复合材料表面行成花瓣簇状形状的HA,形成有利于成骨细胞生长的表面结构。（2）采用体外细胞培养技术,把成骨样细胞MG63和类骨结构胶原纤维基多孔β-TCP/Col复合材料复合培养,以TCP和MG63分别做阳性和阴性对照,用MTT法检测细胞的粘附和增殖变化;ALP活性测定观察材料对细胞分化的影响;扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察细胞在材料中的生长和形念改变;逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和半定量分析检测材料对细胞内骨特异基因表达的影响以及利用流式细胞仪（FCM）观察分析复合材料对细胞周期的影响。结果发现:①细胞在种植到材料表面后随时间延长而黏附的细胞数量增加,纳米β-TCP/Col组高于单纯TCP组（p＜0.05）,而和空白对照组差别不显著（p＞0.05）。②细胞接种5天时,纳米相TCP/Col表面的细胞增殖数明显高于单纯TCP组（p＜0.05）,而和空白对照组无明显差异（p＞0.05）。⑨从复合培养的第5天起,纳米相TCP/Col组细胞分泌的ALP开始增加明显,且高于单纯TCP组,与空白对照组的增加无明显差异。④形态学上SEM可以看到复合材料表面细胞呈扁平梭形,分布均匀、延展性好,随着时间延长并可见到细胞基质分泌沉积;激光共聚焦显微镜显示细胞核分裂活跃。⑤RT-PCR及半定量分析证实,TCP/Col与成骨细胞复合培养后,成骨样细胞内骨钙素和Ⅰ型胶原的表达量明显高于对照组（p＜0.05）。⑥细胞周期分析显示,TCP/Col提高了MG63细胞的细胞周期的S期细胞数百分比,由正常的35.618%增加到了59.480%,表明增加了DNA的合成。（3）选用健康新西兰大白兔24只48侧股骨髁做成圆柱状骨缺损模型,将TCP/Col复合材料植入骨缺损处,设不植入任何材料的骨缺损做空白对照。术后2、4、8、12周进行X线摄片检查,并取材做组织形态学、扫描电镜观察:并对股骨缺损局部骨密度进行测定,初步评价复合材料的骨修复能力。结果发现:①X线显示,2周时骨缺损区密度逐渐增高,材料未发生大量降解;4周时植入区域材料的轮廓变得模糊,植入区域的亮度开始下降,材料的密度开始逐渐降低;8周时缺损区边缘模糊,密度继续降低,植入体与宿主骨部分桥接,骨透射性进一步降低,骨组织向材料内部延伸,材料大部分被降解替代;12周时,材料形状消失,密度与正常组织大致相当,材料与骨组织融合在一起,骨缺损基本被修复。而12周时,对照组缺损区有少量的骨痴和硬化,骨修复征象不明显。②组织切片可见,材料植入2周时,缺损内见大量成骨细胞、纤维组织和新生微血管长入;4周时,植入区有大量小梁骨组织及类骨质形成:8周时,支架材料大部分吸收,类骨质不断增多,形成大量骨岛;12周时,新骨大面积生成,新骨组织渐连接成片,可见哈佛氏系统:对照组在12周时,圆形缺损形态完整,未见到有明显的骨组织形成。③骨密度检测发现,实验组在4周以后骨矿化的速度较对照组明显增高,在12周时,接近正常小梁骨的密度（p＜0.05）。经过上述研究,仿生TCP/Col复合材料具有和骨组织相类似的三维多孔结构,表现出良好的生物相容性和生物活性,在骨缺损修复的过程中对骨的再生有明显的影响,能够加速骨组织的修复,具有良好的骨传导性。因此,类骨结构胶原纤维基多孔TCP/Col复合材料可以成作一种新而有效的骨修复材料。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 第一部分 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 骨的材料学特征
• 1.2.1 骨的成分
• 1.2.2 骨的结构
• 1.3 骨组织的形成及修复
• 1.3.1 骨系细胞及其作用
• 1.3.2 骨组织的修复
• 1.4 骨修复替代材料
• 1.5 复合骨移植材料
• 1.5.1 普通复合骨移植材料
• 1.5.2 纳米磷酸钙/胶原基骨移植材料
• 1.6 研究思路
• 参考文献
• 第二部分 TCP/Col复合材料的制备与表征
• 前言
• 2.1 材料与制备方法
• 2.1.1 材料与设备
• 2.1.2 制备方法
• 2.1.2.1 β相磷酸三钙的制备
• 2.1.2.2 胶原悬浮液制备
• 2.1.2.3 多孔胶原材料制备
• 2.1.2.4 类骨结构胶原纤维基多孔TCP/Col复合材料的制备
• 2.1.3 材料表征
• 2.2 结果
• 2.2.1 煅烧粉末的表征
• 2.2.2 胶原微结构在酸性介质下的变化
• 2.2.3 β-TCP/Col复合材料的表征
• 2.3 讨论
• 2.3.1 酸性介质对胶原微结构的影响分析
• 2.3.2 酸性介质对β-TCP/Col复合材料的影响分析
• 2.3.3 β-TCP/Col复合材料结构单元的分析
• 2.3.4 β-TCP/Col复合材料微观结构的形成过程分析
• 2.3.5 β-TCP/Col复合材料作为支架的可行性
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三部分 TCP/Col复合材料的体外细胞生物学评价
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器、设备及试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 细胞培养
• 3.1.2.2 细胞和支架复合培养
• 3.1.2.3 功能检测
• 3.1.2.3.1 细胞黏附实验
• 3.1.2.3.2 细胞增殖实验
• 3.1.2.3.3 碱性磷酸酶的测定
• 3.1.2.3.4 扫描电镜观察
• 3.1.2.3.5 细胞周期分析
• 3.1.2.3.6 逆转录-聚合酶链式反应
• 3.1.2.3.7 RT-PCR产物的半定量分析
• 3.1.2.3.8 激光共聚焦显微镜检测
• 3.1.2.3.9 统计学处理
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 细胞黏附
• 3.2.2 细胞增殖
• 3.2.3 碱性磷酸酶活性
• 3.2.4 细胞形态观察
• 3.2.5 细胞周期分析
• 3.2.6 RT-PCR分析
• 3.2.7 RT-PCR产物的半定量分析
• 3.2.8 激光共聚焦显微镜下形态分析
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四部分 TCP/Col复合材料修复兔股骨缺损的实验研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验器械及试剂药品
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 骨缺损动物模型制作方法
• 4.1.4 骨骼荧光标记方法
• 4.2 检测指标与方法
• 4.2.1 大体观察
• 4.2.2 影像学检查
• 4.2.3 组织形态学观察
• 4.2.4 骨密度测定
• 4.2.5 统计学处理
• 4.3 结果
• 4.3.1 大体观察
• 4.3.2 X线观察
• 4.3.3 组织学观察
• 4.3.3.1 光境和荧光显微镜观察
• 4.3.3.2 扫描电镜观察
• 4.3.4 骨密度测量结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 复合支架TCP/Col.的骨诱导性
• 4.4.2 仿生型TCP/Col.复合材料的骨传导作用和新骨形成方式
• 4.4.3 仿生型TCP/Col.支架的生物矿化效应
• 4.4.4 仿生型TCP/Col.复合支架的生物降解吸收
• 4.5 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 博士在读期间发表论文和获奖情况
• 致谢