水杨酸提高小麦抗逆性的蛋白质组学研究

论文摘要

水杨酸（salicylic acid, SA）是一种能调节植物生长发育的新型小分子酚类激素,在提高植物抗病中发挥着重要作用。近年来的研究发现,SA除能增强植物的抗病性外,还能显著提高植物对环境胁迫的抗性。目前有关SA提高植物对环境胁迫抗性的研究主要集中在生理水平上,有关其分子机理研究甚少。本研究在筛选可提高小麦抗逆性的SA适宜浓度基础上,进一步研究了采用适宜的SA浓度提高小麦抗逆性和高浓度加剧小麦植株伤害的蛋白质组学机制。主要研究结果如下:1.在正常生长条件下,采用不同浓度的SA（0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0 mM）对小麦幼苗进行预处理,结果表明,低浓度（0.25-0.75 mM）SA处理后,小麦幼苗生长加快,叶色深绿,株高、鲜重和干重显著高于对照;而叶片内丙二醛（malonaldehyde, MDA）含量则显著低于对照,且以0.5 mM浓度的SA处理效果最佳,表明采用低浓度SA处理能促进小麦生长;但当SA浓度大于2 mM时,则显著抑制小麦株高和根长,且叶色变黄,叶片内的MDA含量显著高于对照,表明高浓度SA对小麦幼苗造成了伤害。2.将上述0（对照）、0.5、3 mM SA预处理的小麦幼苗进行盐胁迫（250 mM NaCl）处理3 d后,发现经0.5 mM SA预处理小麦幼苗的株高、幼苗鲜重、干重和叶绿素含量均显著高于未经处理的小麦植株,而叶片内的MDA含量却显著降低,表明使用该浓度处理可降低盐胁迫对小麦幼苗的伤害;但经3 mM SA预处理的小麦幼苗在盐胁迫后,其株高、幼苗鲜重、干重和叶绿素含量均显著低于盐胁迫处理,叶片内的MDA含量甚至显著高于对照,表明采用该浓度处理加剧了盐胁迫对小麦幼苗的伤害。3.本实验采用优化了的小麦叶片蛋白质双向电泳方法,结果表明,用三氯乙酸/丙酮法可从小麦叶片中提取出高质量的蛋白质,所得到的双向电泳图谱蛋白质点数较多,图谱背景也比较清晰,且该方法具有操作简单的特点。在pH 4-7线性24 cm的胶条、蛋白质上样量为1000μg、总聚焦电压时为85000 Vhr等条件下,小麦叶片蛋白质得到了很好的分离,经考马斯亮蓝染色后,所得到的小麦叶片蛋白质图谱效果较好。4.利用上述优化的小麦双向电泳方法,研究了0.5 mM和3.0 mM SA预处理后小麦叶片蛋白质组学的变化,发现与未经SA处理的对照相比,0.5 mM和3.0 mM SA处理小麦叶片后,有15个蛋白质点表现出较大的差异。利用二级质谱肽（LC/ESI-MS/MS）和蛋白数据库分析鉴定这15个差异蛋白,有12个蛋白点得到成功鉴定。其中,1、5-二磷酸核酮糖脱羧/加氧酶大亚基、Rubisco大亚基结合蛋白α亚基、铁氧化还原蛋白-NADP（H）氧化还原酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶在0.5 mM的SA预处理后上调,而在3 mM的SA预处理后下调;丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和ATP合酶亚基在0.5和3.0 mM的SA预处理后都上调;另一个铁氧化还原蛋白-NADP（H）氧化还原酶和一种未知蛋白在0.5和3.0 mM SA预处理后均下调;谷氨酰胺合酶亚基则只在3.0 mM的SA处理后上调。据此推测,这些蛋白质的差异表达可能与不同浓度SA改变小麦的抗逆性密切相关。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 SA 与植物抗病胁迫
• 1.1.1 SA 在植物抗病中的作用
• 1.1.2 SA 在植物抗病中的信号转导途径
• 1.1.3 SA 提高植物抗病性的相关元件的分离鉴定
• 1.2 SA 提高植物抗环境胁迫能力的研究
• 1.2.1 SA 提高植物抗环境胁迫的效应
• 1.2.2 SA 提高植物抗环境胁迫的响应机制
• 1.2.3 SA 提高植物抗环境胁迫能力相关元件的分离鉴定
• 1.2.4 SA 提高植物抗病和抗环境胁迫的异同
• 1.3 SA 提高植物抗病能力和抗环境胁迫能力研究水平的比较
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料、试剂和仪器
• 3.1.1 小麦材料与SA 处理
• 3.1.2 盐处理
• 3.1.3 所用试剂
• 3.1.4 所用仪器
• 3.2 测定项目与方法
• 3.2.1 形态指标
• 3.2.2 生理生化指标
• 3.2.3 蛋白质组分析
• 3.3 蛋白质提取及双向电泳方法
• 3.3.1 蛋白质提取方法
• 3.3.1.1 三氯乙酸/丙酮法（TCA/acetone extraction）
• 3.3.1.2 改良的酚提取法（TCA/acetone/phenol extraction）
• 3.3.2 蛋白质的裂解
• 3.3.3 蛋白质样品浓度测定
• 3.3.4 等电聚焦（IEF）电泳条件的优化
• 3.3.5 IPG 胶条的平衡
• 3.3.6 第二向SDS-PAGE
• 3.3.7 胶体染色
• 3.3.8 凝胶图像分析、蛋白质点的胶内酶解和质谱分析
• 4 结果与分析
• 4.1 SA 对小麦幼苗生长的影响
• 4.2 SA 对小麦幼苗叶片MDA 含量的影响
• 4.3 SA 对盐胁迫条件下小麦幼苗生长的影响
• 4.4 SA 提高植物抗逆性的蛋白质组学研究
• 4.4.1 小麦叶片蛋白质样品的制备
• 4.4.2 不同IPG 胶条对蛋白质分辨率的影响
• 4.4.3 不同上样量对蛋白质分辨率的影响
• 4.4.4 不同聚焦条件对双向电泳图谱的影响
• 4.5 SA 预处理对小麦叶片蛋白组学的影响
• 4.6 差异表达蛋白点的质谱鉴定
• 5 结论与讨论
• 5.1 SA 提高小麦抗逆性的最佳浓度筛选
• 5.2 小麦叶片双向电泳技术的优化
• 5.3 SA 诱导的差异表达蛋白质的功能
• 5.3.1 经0.5 mM SA 预处理后表达量显著上调，而经3 mM SA 预处理后表达量显著下调的差异蛋白
• 5.3.2 经0.5 mM SA 和3 mM SA 预处理后表达量均显著上调或下调的差异蛋白
• 5.3.3 经0.5 mM SA 或3 mM SA预处理后表达量显著上调或下调的差异蛋白
• 参考文献
• ABSTRACT