论文摘要
丁二酮天然存在于月桂油、草莓、奶油、樱桃、蜂蜜、啤酒等物质中,是国家规定允许使用的食品香料。丁二酮产率不高是限制微生物发酵生产丁二酮发展的重要因素。运用分子生物学的手段对菌种进行改造,是提高微生物转化丁二酮产量的重要方法。2,3-丁二醇氧化还原酶是催化丁二酮生物分解代谢的唯一一个酶,而a-乙酰乳酸合成酶是丁二酮生物合成途径中涉及到的第一个酶,也是控制丙酮酸分解的关键性限速酶,这两种酶对丁二酮的产量起着至关重要的作用。本论文的研究目的是通过改造肺炎克雷伯氏菌中编码2,3-丁二醇氧化还原酶的基因和编码α-乙酰乳酸合成酶的基因,从而利用基因工程手段实现丁二酮的生物合成,有望提高丁二酮的产量。本文利用重叠拼接PCR技术构建了含有四环素抗性基因Tcr的同源重组线性片段up-5’budC-Tcr-3’budC-down,电转化K.pneumoniae CICC10011感受态细胞,利用同源重组双交换原理,将重组片段定点插入到染色体2,3-丁二醇氧化还原酶的基因budC+153～+604区（budC起始编码框为+1）位点上,获得了具有四环素抗性的budC-突变株,命名为重组菌株K. pneumoniae CICC10011-0。通过葡萄糖摇瓶发酵实验,利用气相色谱分析代谢产物,结果表明,相同发酵条件下,野生菌不产丁二酮,重组菌株CICC10011-0的丁二酮产量达到0.14g/1,重组菌株CICC10011-0比野生菌的葡萄糖利用率低81.25%,3-羟基丁酮、2,3-丁二醇和乙醇产量均下降了约100%,乙酸产量提高了209.33%,达5.67g/1。以Klebsiella pneumoniae CICC10011基因组为模板,利用PCR技术扩增得到α-乙酰乳酸合成酶的基因als,将其连接到表达载体pBR322上。通过电击转化的方法,将重组质粒pBR-322-als导入Klebsiella pneumoniae CICC10011,构建过量表达编码α-乙酰乳酸合成酶基因的工程菌,命名为重组菌株Klebsiella pneumoniae CICC10011-1。通过葡萄糖摇瓶发酵实验,α-乙酰乳酸合成酶活分析,发现重组菌株CICC10011-1的α-乙酰乳酸合成酶的比酶活为0.6367U/mg蛋白,是出发菌株CICC 10011的3倍；利用气相色谱测定代谢产物量,结果表明,重组菌株CICC10011-1与野生菌都不产丁二酮,3-羟基丁酮和2,3-丁二醇的浓度与野生菌相比均有所提高,乙醇和乙酸的浓度均有所降低。综上,在Klebsiella pneumoniae CICC10011胞内代谢中,丁二酮对α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶可能起到反馈抑制作用；α-乙酰乳酸合成酶并不是丁二酮、3-羟基丁酮和2,3-丁二醇生成的关键调控点。
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标签：肺炎克雷伯氏菌论文; 丁二酮论文; 丁二醇氧化还原酶论文; 乙酰乳酸合成酶论文;