结缕草胁迫诱导型启动子Rd29A的克隆及其功能鉴定

论文摘要

Rd29A基因启动子是一个受干旱、高盐和低温等逆境诱导表达的特异性启动子,也是植物抗逆性基因工程中理想的逆境诱导型启动子。本研究的目的是从结缕草中分离出Rd29A基因启动子,并对其序列进行测序、比较和分析,鉴定该启动子的功能。筛选出适用于草坪草转基因的诱导型启动子,促进草坪草转基因技术的发展,对于逆境条件下结缕草的生长发育有重要意义。根据文献上发表的Rd29A基因启动子序列设计并合成了特异引物,以我国野生的结缕草为实验材料,通过PCR方法从该结缕草样品基因组DNA中扩增到目的片断,并进行了测序、比较和分析,与GenBank报道的Rd29A基因启动子序列相比较,同源性为41.65%。该序列在GenBank上的登录号是:EU346948。利用GFP和GUS基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性pBIG（35S-GFP）、pBIRG （Rd29A-GFP）和pBI（35S-GUS）、pBIR （Rd29A-GUS）四个植物真核表达载体,采用基因枪法对洋葱表皮细胞进行遗传转化。在胁迫诱导后,检测目的片段在受体细胞中调控基因表达的活性,从而鉴定其功能。结果表明克隆到的目的片段具有启动子功能,并且在干旱、高盐、低温诱导胁迫下更能强烈地驱动下游基因的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1. 启动子结构和功能的研究现状
• 1.1 启动子功能和结构研究的策略
• 1.1.1 转化分析
• 1.1.2 瞬间表达分析
• 1.1.3 点突变分析
• 1.1.4 RNA 干涉技术
• 1.2 组成型启动子的功能和结构特征
• 1.3 组织特异型启动子的功能和结构
• 1.4 诱导型启动子的功能和结构
• 2.启动子克隆方法的研究进展
• 2.1 利用启动子探针载体筛选启动子
• 2.2 利用PCR 技术克隆启动子
• 2.3 环状PCR
• 2.3.1 I-PCR
• 2.3.2 P-PCR
• 2.4 YADE 法
• 2.5 TAIL-PCR
• 3. 本研究的意义、内容与技术路线
• 3.1 研究背景、目的与意义
• 3.2 研究的内容
• 3.3 技术路线
• 第二章 目的片段的克隆和序列分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.1.1 植物材料的生态习性
• 1.1.1.2 植物材料的坪用特性
• 1.1.2 质粒与菌株
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 植物总DNA 的提取
• 1.2.2 制备感受态细胞大肠杆菌的Inoue 方法
• 1.2.3 感受态细胞的效价测定
• 1.2.4 目的片段的克隆
• 1.2.4.1 引物设计的原则
• 1.2.4.2 PCR 扩增反应
• 1.2.4.3 电泳目的基因片段的回收
• 1.2.4.4 连接反应
• 1.2.4.5 感受态细胞的转化
• 2. 结果与分析
• 2.1 提取植物总DNA
• 2.2 感受态细胞的制备
• 2.3 感受态细胞的效价测定
• 2.4 目的片段的克隆
• 2.5 测序结果与分析
• 3. 讨论
• 3.1 植物总DNA 的提取
• 3.2 制备大肠杆菌的感受态细胞
• 3.3 感受态细胞的效价测定
• 3.4 目的片段的克隆
• 3.4.1 PCR 扩增反应
• 3.4.2 连接及转化反应
• 3.5 研究展望
• 第三章 目的片段的功能鉴定
• 1.G FP 报告基因的瞬时表达
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.1.1 受体材料和试剂
• 1.1.1.2 载体和菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 基因枪转化法
• 1.1.3.1 两种启动子分别驱动的GFP 基因植物表达载体的构建
• 1.1.3.2 金粉DNA 复合体的制备
• 1.1.3.3 受体材料的处理
• 1.1.3.4 受体材料的轰击
• 1.1.3.5 洋葱表皮细胞中GFP 基因瞬时表达的检测
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 目的片段驱动的GFP 基因植物表达载体的构建
• 1.2.2 GFP 基因的瞬时表达
• 1.3 讨论
• 2.G US 报告基因的瞬时表达
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 受体材料和试剂
• 2.1.1.2 载体和菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.2.1 细菌培养基
• 2.1.2.2 受体材料培养基
• 2.1.3 基因枪转化法
• 2.1.3.1 两种启动子分别驱动的GUS 基因植物表达载体的构建
• 2.1.3.2 洋葱表皮细胞中GUS 基因的活性染色
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 目的片段驱动的GUS 基因植物表达载体的构建
• 2.2.2 GUS 基因活性染色分析
• 2.3 讨论
• 第四章 结论
• 1. 结缕草 Rd29A 基因启动子的克隆
• 2. Rd29A 基因启动子的功能鉴定
• 2.1 GFP 基因的瞬时表达
• 2.2 GUS 基因的瞬时表达
• 参考文献
• 附图I
• 附图II
• 个人简介
• 导师简介
• 获得成果目录清单
• 致谢