去甲斑蝥素对人食管癌Eca9706细胞凋亡及caspase-3、sirvivin和NF-kb蛋白表达的影响及意义

论文摘要

目的:食管癌的防治研究长期以来成为人们关注的研究课题。探索积极有效的化学防治手段以降低食管癌的死亡率极为重要。去甲斑蝥素（NCTD）是将从中药斑蝥中提取的抗肿瘤活性成分斑蝥素去1、2位甲基合成而得,具有显著的抗癌作用。本研究通过体外培养食管癌Ec9706细胞,研究去甲斑蝥素作用后细胞的增殖及凋亡,以及其对细胞凋亡通路中心因子才caspase-3、凋亡抑制蛋白survivin及核转录因子NF-κB蛋白表达的影响,探讨去甲斑蝥素抗食管癌细胞的作用机制,为其治疗食管癌提供实验依据。方法:1去甲斑蝥素作用Ec9706细胞后MTT法检测肿瘤细胞增殖抑制率96孔板对食管鳞癌细胞株Ec9706进行常规培养,用不同浓度的去甲斑蝥素（0、5、10、20、40μg/ml）进行干预,分别作用6、12、24和48小时。应用MTT法测定其对细胞的生长抑制作用,并得出半数抑制浓度IC50。2 FCM定量检测细胞凋亡及凋亡调控因子的表达对食管鳞癌细胞株Ec9706进行常规培养,设对照组和去甲斑蝥素IC50干预实验组,分别作用12、24和48小时。收集细胞,70%乙醇固定,流式细胞术检测,采用碘化丙啶一步插入性DNA荧光染色方法,检测样品的DNA含量,分析DNA倍体;采用间接免疫荧光标记方法定量检测Caspase-3、survivin、NF-κB蛋白的表达,并分析各因子之间相关性。3免疫细胞化学检测Survivin、Caspase-3以及NF-κB蛋白的表达6孔板食管癌Ec9706细胞进行常规培养,设实验组与对照组,采用去甲斑蝥素对食管鳞癌细胞株Ec9706的半数抑制浓度IC50进行干预,作用12、24和48小时。免疫组化SP法检测Survivin、Caspase-3以及NF-κB蛋白的表达,分析阳性表达率。结果:1去甲斑蝥素对Ec9706细胞凋亡的影响MTT法检测,去甲斑蝥素对Ec9706细胞生长有抑制作用,并在一定范围内呈时效和量效依赖关系,数据分析得出去甲斑蝥素作用24h对细胞生长的半数抑制浓度（IC50）为13.241μg/ml,约10μg/ml。流式细胞仪分析细胞凋亡,在DNA组方图上出现典型的亚二倍体峰即“凋亡峰”,细胞凋亡率与去甲斑蝥素作用在一定范围内呈时间和剂量依赖关系。去甲斑蝥素作用后,Ec9706细胞在细胞周期中的分布发生了明显的变化,随着作用时间延长和药物浓度的增加,G0/G1期细胞数逐渐增加,S和G2/M期细胞数逐渐减少,有时效和量效依赖关系。DNA琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯状条带。2去甲斑蝥素对Ec9706细胞凋亡调控因子表达的影响去甲斑蝥素IC50对Ec9706细胞分别作用12、24和48小时后,流式细胞仪检测分析蛋白定量。Caspase-3蛋白表达水平相对于对照组逐渐升高。Survivin蛋白表达水平相对于对照组逐渐降低。药物作用时间较短时,NF-κB蛋白表达相对于对照组表现为升高,但随着药物作用时间的延长,NF-κB蛋白表达相对于对照组逐渐降低。免疫细胞学检测,采用去甲斑蝥素对Ec9706细胞半数抑制浓度IC50作用12、24和48小时。处理组中,Caspase-3蛋白阳性表达率明显高于对照组,Survivin蛋白阳性表达率明显低于对照组。对照组中,NF-κB蛋白在细胞中呈阳性表达;处理组,药物作用时间较短时,NF-κB蛋白阳性表达率相对于对照组升高,但随着药物作用时间的延长,NF-κB蛋白阳性表达率相对于对照组逐渐降低。结论:1去甲斑蝥素对人食管癌Ec9706细胞的生长有抑制作用,其生长抑制是通过诱导肿瘤细胞凋亡和干扰细胞增殖活性。2本实验证实,去甲斑蝥素抑制人食管癌Ec9706细胞增殖,上调Caspase-3蛋白的表达,下调survivin和NF-κB蛋白的表达,可能与直接或间接调节细胞膜死亡受体相关的Caspase信号传导途径或（/和）线粒体相关的Caspase信号传导途径有关。3去甲斑蝥素诱导人食管癌Ec9706细胞凋亡的过程中,Caspase-3蛋白表达逐渐增强; survivin蛋白表达逐渐减弱;NF-κB蛋白在去甲斑蝥素作用时间较短时表达增强,但随着药物作用时间的延长,NF-κB蛋白表达降低,提示去甲斑蝥素刺激后短时间内作用较弱,随刺激时间的延长其对三者影响逐渐增强。caspase-3和Survivin蛋白表达有相关关系（P<0.01）,但其它基因之间无明显相关关系（P>0.05）。可以确定去甲斑蝥素通过多点诱导、多信号传导途径引发了人食管癌Ec9706细胞的凋亡发生,其具体作用机制有待进一步研究。

论文目录

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• 研究论文去甲斑蝥素对人食管癌Ec9706 细胞凋亡及caspase-3、survivin、和NF-κB 蛋白表达的影响及意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 去甲斑蝥素抗肿瘤作用研究热点
• 致谢
• 个人简历