莠去津降解细菌HB-5的鉴定、发酵及其降解酶初步纯化的研究

论文摘要

HB-5是本实验室从农药厂废水中分离得到的一株莠去津降解细菌,前期研究结果表明,根据降解菌HB-5的菌体、菌落形态以及生理生化特性测定,初步鉴定其为革兰氏阳性的节杆菌属;当温度为35℃,pH为8.5时,降解酶对莠去津的降解率最高。本文以莠去津降解细菌HB-5作为主要的研究对象,利用现代分子生物学的手段对其进行了鉴定;对HB-5产降解酶的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了优化,并对其产生的降解酶的分离纯化进行了初步探讨。主要内容如下:1.介绍了莠去津的理化性质、国内外应用概况,以及由于其广泛应用所带来的环境污染问题;在对前人工作总结分析的基础上,对莠去津在环境介质中的残留动态、降解代谢以及生物修复技术进行了综述;并对16S rRNA基因序列的同源性分析用于细菌系统分类鉴定,莠去津降解细菌的摇瓶发酵研究以及酶的分离纯化等方面进行了简要概括。进而提出了作者要研究的问题。2.通过对菌株HB-5的16S rDNA序列的同源性分析,菌株HB-5与Arthrobacter sp. AD3同源性达99.3%,进一步将其鉴定为节杆菌属（Arthrobacter）。3.以从降解细菌HB-5中提取到的降解酶对莠去津的降解率为指标,进行最佳产酶培养基及发酵条件的研究,以提高其产酶量。通过单次单因子试验、正交试验和均匀试验,对细菌HB-5的发酵培养基与发酵条件进行了优化。结果表明,最佳发酵培养基配方为:蔗糖3.0g·L-1,莠去津0.38g·L-1,K2HPO4 0.5g·L-1,KH2PO4 1.2g·L-1,MgSO4·7H2O 1.2g·L-1,NaCl 0.1g·L-1,微量元素溶液3.8mL·L-1。最佳发酵条件为:培养时间48h,接种量2%,发酵液初始pH 9, 250mL的三角瓶装液量为80mL。运用最佳发酵培养基在最优条件下发酵,降解酶对莠去津的降解率（91.64%）比原培养基（40.67%）提高了125%。4.对降解细菌HB-5产生的降解酶进行了分离纯化研究。提取到的降解酶粗酶液经30%-70%硫酸铵分级沉淀,得到的酶液利用透析袋透析去除硫酸铵及其小分子物质,酶液进一步利用DEAE Sepharose FF离子交换柱层析和Sephacryl S-300HR分子筛层析进行了分离纯化,得到一个具有降解活性的分离组分。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 莠去津的结构和理化性质
• 1.2 莠去津的除草机理及应用概况
• 1.3 莠去津在生物体内和环境中的代谢
• 1.3.1 动植物体内的代谢
• 1.3.2 水环境、土壤中的降解代谢
• 1.4 莠去津的污染状况及生态毒理学效应
• 1.4.1 莠去津的污染状况
• 1.4.2 莠去津污染的生态毒理学效应
• 1.5 莠去津生物降解
• 1.5.1 降解莠去津的微生物
• 1.5.2 莠去津生物降解的影响因素
• 1.5.3 莠去津生物降解研究进展
• 1.6 分子生物学方法鉴定细菌现状
• 1.7 莠去津降解菌的摇瓶发酵研究
• 1.8 酶的分离纯化
• 1.9 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 药品试剂
• 2.2 仪器设备
• 2.3 菌种和培养基
• 2.4 降解菌的培养及其降解酶的提取
• 2.4.1 降解菌的培养
• 2.4.2 降解酶的提取
• 2.5 莠去津降解率的测定
• 2.5.1 莠去津降解酶酶促反应
• 2.5.2 水样中莠去津的GC-FID 色谱分析条件
• 2.5.3 降解率的计算
• 2.6 16S rDNA 片段扩增和序列分析
• 2.6.1 细菌总DNA 的提取
• 2.6.2 16S rDNA 片段的 PCR 扩增
• 2.6.3 PCR 产物的纯化
• 2.6.4 质粒载体与目的DNA 连接
• 2.6.5 感受态细胞制备
• 2.6.6 转化
• 2.6.7 重组质粒的检测
• 2.6.8 16S rDNA 基因的核苷酸序列测定
• 2.6.9 16S rDNA 的序列分析
• 2.7 降解菌发酵培养基与发酵条件的研究
• 2.7.1 降解菌发酵培养基的优化
• 2.7.1.1 最优碳源浓度的选择
• 2.7.1.2 最优氮源浓度的选择
• 2.7.1.3 最优无机盐浓度的选择
• 2.7.1.4 微量元素溶液终浓度的选择
• 2.7.1.5 发酵培养基最佳配方的均匀试验设计
• 2.7.2 降解菌发酵条件的优化
• 2.7.2.1 最佳培养时间的选择
• 2.7.2.2 最佳接种量的选择
• 2.7.2.3 最适初始 pH 值的选择
• 2.7.2.4 最佳装液量的选择
• 2.7.3 发酵培养基与发酵条件的验证试验
• 2.8 降解酶的分离纯化
• 2.8.1 硫酸铵分级沉淀
• 2.8.2 透析脱盐
• 2.8.3 DEAE-Sepharose FF 阴离子交换柱层析
• 2.8.4 Sephacryl S-300HR 分子筛层析
• 3 结果与分析
• 3.1 降解菌HB-5 的16S rDNA 序列分析
• 3.1.1 16S rDNA 基因 PCR 扩增结果
• 3.1.2 菌株HB-5 的16S rDNA 序列测定结果
• 3.1.3 菌株 HB-5 的16S rDNA 序列分析
• 3.1.4 16S rDNA 系统进化树的建立
• 3.2 降解菌发酵培养基与发酵条件的研究
• 3.2.1 降解菌发酵培养基的优化
• 3.2.1.1 碳源浓度的选择
• 3.2.1.2 氮源浓度的选择
• 3.2.1.3 不同无机盐浓度的选择
• 3.2.1.4 微量元素溶液终浓度的选择
• 3.2.1.5 发酵配方均匀试验设计结果
• 3.2.2 降解菌发酵条件的优化
• 3.2.2.1 培养时间的选择
• 3.2.2.2 接种量的选择
• 3.2.2.3 初始 pH 值的选择
• 3.2.2.4 装液量的选择
• 3.2.3 发酵培养基与发酵条件优化结果的验证
• 3.3 莠去津降解酶的分离纯化
• 3.3.1 硫酸铵分级沉淀
• 3.3.2 DEAE-Sepharose FF 阴离子交换柱层析
• 3.3.3 Sephacryl S-300HR 分子筛层析
• 4 讨论
• 4.1 莠去津降解酶研究
• 4.2 降解菌的菌株鉴定
• 4.3 降解菌的发酵技术
• 4.4 降解酶的纯化技术
• 5 结论
• 5.1 降解菌HB-5 菌株鉴定
• 5.2 降解酶发酵条件研究
• 5.3 降解酶的分离纯化
• 本研究的创新之处
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士期间发表论文