白血病干细胞靶向治疗及耐药逆转

论文摘要

白血病治疗中的耐药、复发等问题,根本原因在于患者体内存在着一群白血病干细胞（LSC）。LSC在干细胞中所占比例极少,位于细胞克隆起始阶段,和正常干细胞一样能自我更新、具有分化潜能,但却没有正常干细胞的自我调控能力,在细胞到达分化末端前就已停止分化,功能紊乱的LSC大量增殖引发白血病。LSC95%以上处于G0期,呈休眠状态,与目前化疗药物大多针对肿瘤细胞周期活跃期的作用机制冲突,同时发现与多药耐药密切相关的mdr1、BCRP和MRP基因在LSC均高表达,这就揭示了LSC能成功逃逸化疗并最终导致白血病复发的真正原因,也揭示了白血病治疗的根本是在保证不损害正常造血干细胞功能的前提下定向清除患者体内的LSC。基于以上理论本实验从两方面展开了针对LSC的治疗研究:1、对LSC表面特异性抗原的研究发现,白细胞介素3受体α链（IL-3Rα链）即CD123抗原,是特异识别并结合白细胞介素3（IL-3）的关键部位,在急性髓系白血病干细胞表面高表达,同时在正常造血干细胞表面几乎不表达,是探索根治急性髓系白血病的重要靶点。力达霉素（LDM）是近年发现的具有强烈抗肿瘤能力的烯二炔类大分子蛋白毒素,由非共价键连接的活性发色团（LDC）和保护发色团的酸性蛋白（LDP）组成。且对mdr1高表达的多药耐药细胞株未表现出抗药性,体内毒副作用小。本实验将IL-3与力达霉素酸性保护蛋白融合成IL3-G4S-LDP,研究其在大肠杆菌中的高效表达及表达产物与靶细胞结合的生物学活性,为体外组装活性发色团后靶向杀伤LSC奠定基础。实验采用PCR法扩增IL3和LDP的编码DNA序列,经酶切、连接,克隆至表达载体pAYZ,转化E.coli 16C9,经测序鉴定阳性克隆菌落插入片段可正确编码849bp的融合蛋白。经低磷培养基AP5诱导表达融合蛋白,用CM-FF阳离子柱和抗-Etag亲和层析柱纯化,蛋白纯度达95%以上,纯化产物经SDS-PAGE和Westem blot鉴定,其表达形式主要为周质腔可溶性蛋白,表达量约为1mg/1。FACS测定融合蛋白与CD123（+）靶细胞TF-1的结合活性,结合率接近99%。2、PHⅡ-7是本室自主研发的氧化吲哚类抗肿瘤药物,最大特点是抑制人多种来源、多种耐药表型的耐药肿瘤细胞生长,其中PHⅡ-7下调耐药基因sorcin、mdr1的表达已被证实。这就提示PHⅡ-7很可能同样下调MRP的表达,成为逆转LSC MRP耐药表型的良药。且PHⅡ-7本身通过改变肿瘤细胞的周期分布兼具细胞毒性,具有很好的应用前景。本实验选用MRP高表达、其他耐药基因几乎不表达的耐药肿瘤细胞株HL60/ADR及其亲代细胞系HL60为研究对象,MTT法检测PHⅡ-7对阿霉素抗肿瘤活性的协同作用。HL-60组CDI值为0.7＜1,HL-60/ADR组CDI值为0.43＜0.7,PHⅡ-7对耐药肿瘤细胞的协同作用显著。提取不同浓度PHⅡ-7处理不同时间的HL-60和HL-60/ADR细胞mRNA,RT-PCR法分析PHⅡ-7对MRP基因表达水平的影响,发现PHⅡ-7能明显下调肿瘤细胞内MRP的表达水平,二者存在时间和剂量依赖关系。通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察PHⅡ-7处理前后,HL-60和HL-60/ADR细胞内阿霉素的浓度,发现随着PHⅡ-7作用时间延长,细胞内阿霉素浓度明显提高,至96h时耐药肿瘤细胞HL-60/ADR内的阿霉素浓度可从未经处理时仅为敏感细胞的22.4%升高到55%。以上结果充分验证PHⅡ-7逆转耐药基因MRP表达的推测。LSC的发现使研究者们认识了白血病发生发展、耐药复发等一系列问题的本质,使彻底清除LSC成为目前根治白血病的可能正确途径。以上研究结果充分证明以CD123等特异抗原为靶向、依靠不断发现的PHⅡ-7等新型抗肿瘤药物实现对LSC的杀伤是可行的、其前景是乐观的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 融合蛋白IL3-G4S-LDP的构建和表达
• 前言
• 1、实验材料
• 2、试验方法
• 3、试验结果
• 4、结论
• 第二部分 PHⅡ-7协同增强阿霉素杀伤肿瘤细胞的作用及机制研究
• 前言
• 1、实验材料
• 2、实验方法
• 3、实验结果
• 4、结论
• 讨论
• 参考文献
• 附录一、常见英文缩略词汇表
• 附录二、溶液配制
• 综述
• 致谢
• 附录