Leptin在脑缺血性损伤中的神经保护作用和机制探讨

论文摘要

脑缺血后梗死的病理变化为能量缺乏、脑水肿、炎症、自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性作用和凋亡级联的启动等,寻找有效的神经保护因子,对脑缺血损伤的主要环节进行干预,减轻神经损伤、恢复神经功能一直是人们研究的热点。瘦素（Leptin）是一种中枢性能量代谢调节因子,在炎症反应和创伤修复方面也具有重要功能,最近有关其神经保护作用的研究引起广泛关注,但是研究者对其作用机制还知之甚少。为了解Leptin在脑缺血再灌注损伤中的作用及其病理生理机制,本研究拟建立小鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型、原代培养神经元、星形胶质细胞缺血缺氧/复氧损伤模型,探讨Leptin对脑缺血性损伤后神经元、星形胶质细胞功能状态的调节及其作用机制。本课题包括以下两个部分工作:第一部分Leptin在小鼠脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用和机制探讨目的:通过小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,对Leptin的神经保护作用及机制进行探讨。方法:用线栓法制作小鼠右侧大脑中动脉栓塞/再灌注（MCAO/R）模型。①检测125I-Leptin在组织中的摄入和代谢情况;②激光多普勒监测大脑中动脉栓塞前后血流变化,小鼠神经功能评分、TTC染色测定脑梗死体积、HE染色检测组织病理学变化;③免疫组化检测脑组织中GFAP阳性星形胶质细胞和NSE阳性神经元;④检测梗死侧脑组织匀浆中LD/LDH、SOD/MDA、NO/NOS含量的动态变化;⑤TUNEL染色检测神经元凋亡,RT-PCR和免疫组化方法检测脑组织中凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3的表达;⑥免疫组化方法检测脑组织中神经营养因子NGF、BDNF的表达。结果:1.小鼠局灶性脑缺血模型建立后血流量下降67%左右,再灌后开始恢复,再灌注24h后Leptin干预组血流量恢复情况较模型组明显改善（P＜0.01）;2.Leptin干预能够明显改善神经功能评分（P＜0.05）,缩小脑梗死体积（P＜0.01）,呈时间和剂量依赖性;3.MCAO/R术后脑组织中的LD、LDH、MDA、NO和NOS含量明显升高、SOD含量明显降低（与假手术比较,P＜0.05）;Leptin干预能够使LD、LDH、MDA、NO和NOS这几项损伤因子水平显著降低、SOD含量明显升高（与模型组比较,P＜0.05）;4.Leptin干预组神经细胞变性、坏死程度减轻,组织充血及水肿程度减轻;NSE表达明显增强（P＜0.001）,GFAP阳性星形胶质细胞形态接近正常,GFAP表达明显增强（P＜0.01）;5.Leptin干预组脑组织缺血半影区TUNEL阳性细胞数明显少于模型组（P＜0.01）;脑组织匀浆bcl-2 mRNA表达显著高于模型组,bax、caspase-3mRNA表达显著低于模型组（P＜0.01）;免疫组织化学结果显示脑缺血半影区Bcl-2阳性细胞光密度值明显高于模型组,caspase-3阳性细胞光密度值明显低于模型组（P＜0.05）;6.免疫组织化学结果显示,Leptin干预组半影区NGF蛋白表达明显高于假手术组（P＜0.01）,BDNF蛋白表达较假手术组和模型组显著增加（P＜0.01）。结论:1.外源性Leptin能够通过血脑屏障,在小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤发挥改善神经功能、缩小脑梗死体积、减少神经元坏死等神经保护作用;2.Leptin在小鼠脑缺血再灌注损伤后可显著降低缺血侧脑组织匀浆中LD、LDH、MDA、NO和NOS水平,升高SOD水平,在阻断脂质过氧化、促进自由基清除,维持内环境的稳定方面具有积极作用;3.Leptin在脑缺血再灌注损伤中可通过上调抑凋亡基因bcl-2表达、下调促凋亡基因bax、caspase-3表达,减少神经细胞凋亡,改善卒中的预后;4.Leptin在脑缺血再灌注损伤中能够上调神经营养因子NGF、BDNF蛋白表达,改善神经功能。第二部分脑缺血性损伤中Leptin通过星形胶质细胞对神经元所发挥的作用目的:通过神经元和星形胶质细胞缺血缺氧/复氧损伤模型,探讨Leptin-星形胶质细胞-神经元三者在脑缺血性损伤中的关系。方法:①双重免疫荧光检测Leptin对MCAO/R小鼠脑组织缺血半影区星形胶质细胞和神经元的影响;②体外培养、纯化鉴定SD乳鼠神经元、脑皮质星形胶质细胞,换用无血清低糖培养基在5%CO2+95%N2密闭盒中孵育,建立缺血缺氧/复氧损伤模型,RT-PCR鉴定星形胶质细胞中Leptin受体Ob-Ra、Ob-Rb的表达;③RT-PCR和Western Blot方法检测Leptin对受损的星形胶质细胞凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3表达的影响;④细胞毒性实验（MTT）检测星形胶质细胞和神经元存活率;⑤测定星形胶质细胞培养液中LDH、MDA的含量及神经元培养液中LDH漏出率;⑥采用Annexin V-FITC试剂盒检测星形胶质细胞和神经元凋亡;⑦免疫细胞化学方法检测星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白质（GFAP）的表达;⑧ELISA检测星形胶质细胞培养上清NGF表达。结果:1.模型组半影区星形胶质细胞过度增生,神经元较少;Leptin干预组半影区星形胶质细胞形态基本正常,GFAP表达较对照组明显增强,神经元数量较模型组明显增多;2.Leptin对缺血缺氧/复氧损伤星形胶质细胞的影响:①与损伤组比较,Leptin干预组星形胶质存活率显著升高,细胞培养上清中LDH、MDA水平显著降低（P＜0.05）;②与损伤组比较,Leptin干预组凋亡率显著降低（P＜0.01）,抑凋亡基因bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著上调（P＜0.01）,促凋亡基因bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著下调（P＜0.01）,呈剂量依赖性;③Leptin干预组细胞培养液中NGF水平较缺血缺氧损伤组明显升高（P＜0.05）;3.Leptin与星形胶质细胞培养液均可明显提高缺血缺氧/复氧损伤神经元存活率、降低LDH漏出率、减少神经元凋亡（P＜0.05）,二者叠加后效果增强。结论:1.Leptin能够提高神经元、星形胶质细胞对缺血缺氧/复氧损伤的耐受性;2.Leptin能够减少缺血缺氧/复氧损伤神经元、星形胶质细胞凋亡,后者与凋亡相关基因bcl-2表达上调、caspase-3表达下调有关;3.Leptin能够促进星形胶质细胞生成神经营养因子NGF;4.Leptin既可直接保护受损神经元,还可以间接通过星形胶质细胞对神经元发挥保护作用,二者叠加后效果增强。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 Leptin在小鼠脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用和机制探讨
• 1.实验材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.Leptin对脑缺血再灌注损伤中对神经营养因子NGF和BDNF表达的作用
• 5.讨论
• 第二部分 脑缺血性损伤中Leptin通过星形胶质细胞对神经元所发挥的作用
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果
• 4.讨论
• 5.问题与展望
• 主要结论
• 参考文献
• 文献综述
• 综述一 瘦素与其受体的交互作用与信号转导
• 综述二 瘦素神经保护作用的研究进展
• 缩略词语
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢