不同粉尘对大鼠肺泡巨噬细胞表面受体MARCO表达影响的体外研究

论文摘要

长期以来,尘肺病是中国职业病中发病率最高、对劳动者危害最为严重的一类职业病。最新统计报告显示,2010年尘肺病发病例数占职业病报告总例数的87.42%,而且其发病工龄有明显缩短的趋势,尘肺病的发生严重危害着职业人群的健康状况及生活质量。多年来研究者一直致力于其发病机制的研究。生产性粉尘进入肺部后,肺泡巨噬细胞作为参与机体防御的首类效应细胞,在尘肺的发生发展中发挥着至关重要的作用。一直以来大多数的研究均致力于粉尘作用于巨噬细胞后引起的一系列变化,然而有关巨噬细胞如何识别并吞噬粉尘颗粒的过程尚不清楚,近年来国外有研究结果显示巨噬细胞对矽尘的吞噬并非是简单的异物吞噬反应,而是通过巨噬细胞表面表达的模式识别受体MARCO来介导的,这一发现为尘肺病的研究提供了新的线索。胶原样结构巨噬细胞受体（Macrophage receptor with collagenous structure, MARCO）是巨噬细胞表面A类清道夫受体的一种。国外研究发现MARCO参与肺泡巨噬细胞对矽尘的吞噬,而且矽尘作用于肺泡巨噬细胞后可以导致该受体表达的增加。除了矽尘,其它很多粉尘也能引起尘肺病,在中国,煤尘所致的尘肺病要高于矽尘,占据相当大的比例。而氧化锌粉尘则是一种重要的金属粉尘,也可对肺部造成严重损伤。因此,基于国外的研究,煤尘和氧化锌粉尘与肺泡巨噬细胞的作用方式是否也经MARCO受体而被肺泡巨噬细胞所吞噬引起了我们的兴趣。因此,该研究拟通过体外实验,原代培养SD大鼠肺泡巨噬细胞,使用游离Si02粉尘、煤尘以及氧化锌粉尘作用肺泡巨噬细胞,检测不同粉尘刺激对肺泡巨噬细胞表面受体MARCO表达的影响,探讨肺泡巨噬细胞吞噬二氧化硅粉尘、煤尘和氧化锌粉尘的方式。目的：检测游离Si02、煤尘以及氧化锌3种粉尘对肺泡巨噬细胞表面MARCO受体表达的影响,探讨巨噬细胞对煤尘和氧化锌粉尘的吞噬作用方式。方法：1.对SD大鼠的肺泡巨噬细胞进行分离纯化和原代培养。2.采用MTT比色法测定各粉尘对原代培养的巨噬细胞活性的影响,并确定染毒巨噬细胞的粉尘浓度。3.使用Real-time PCR检测不同浓度粉尘刺激后肺泡巨噬细胞表面清道夫受体MARCO的mRNA相对表达水平。4.采用Western blot技术检测不同浓度粉尘刺激后肺泡巨噬细胞表面清道夫受体MARCO的蛋白表达水平。5.统计学分析：使用SPSS12.0统计软件,采用Levene方法进行方差齐性检验,各组之间采用单因素方差分析,两两比较用q检验,统计学上的显著性检验以a=0.05为检验水准。结果：1.分离得到的SD大鼠肺泡巨噬细胞的成活率在95%以上,培养2h后巨噬细胞贴壁状态良好,纯化后巨噬细胞纯度达95%以上。2.各粉尘对原代培养的巨噬细胞活性的影响：（1）游离Si02粉尘浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml时,巨噬细胞活性与对照组0μg/ml进行比较,差异无统计学意义（P>0.05）,当大于100μg/ml浓度时,细胞活性明显受到影响,因此,游离Si02粉尘对细胞的染毒浓度设定在100μg/ml以内（0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml）;（2）煤尘浓度为50μg/ml、10μg/ml、200μg/ml、400μg/ml时,细胞活性与对照组0μg/ml比较,差异无统计学意义（P>0.05）,当大于400μg/ml浓度时,细胞活性较对照组明显降低。因此,煤尘对细胞的染毒浓度设定在400μg/ml以内（0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml）;（3）氧化锌粉尘浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml时,巨噬细胞活性与对照组0μg/ml比较,差异无统计学意义（P>0.05）,当大于200μg/ml浓度时,细胞活性明显受到影响。因此,金属氧化锌粉尘对细胞的染毒浓度设定在200μg/ml以内（0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml）。3. Real-time PCR检测各组细胞MARCO的mRNA表达结果：（1）游离SiO2粉尘各浓度组与对照组相比,染毒浓度在50μg/ml、75μg/ml和100μg/ml时,MARCO的mRNA表达量高于对照组,且差异具有统计学意义（P<0.05）；（2）煤尘各浓度组与对照组相比,染毒浓度在200μg/ml和400μg/ml时,MARCO的：mRNA表达量高于对照组,且差异具有统计学意义（P<0.05）；（3）氧化锌粉尘各浓度组与对照组相比,染毒浓度在100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml时,MARCO的mRNA表达量高于对照组,且差异具有统计学意义（P<0.05）。4. Western blot检测各组细胞MARCO的蛋白表达结果：（1）游离SiO2粉尘各浓度组与对照组相比,作用浓度在75μg/ml和100μg/ml时,MARCO的蛋白表达量明显高于对照组,且差异具有统计学意义（P<0.05）；（2）煤尘各浓度组与对照组相比,作用浓度在100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml时,MARCO的蛋白表达量明显高于对照组,且差异具有统计学意义（P<0.05）；（3）氧化锌粉尘各浓度组与对照组相比,作用浓度在150μg/ml和200μg/ml时,MARCO的蛋白表达量明显高于对照组,且差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：游离SiO2、煤尘以及氧化锌3种粉尘作用于肺泡巨噬细胞后,均能使其表面MARCO的表达水平增加。肺泡巨噬细胞对煤尘和氧化锌粉尘的吞噬方式很有可能与游离SiO2一致,即通过MARCO介导肺泡巨噬细胞吞噬。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 图和附表清单
• 中英文缩略词表
• 前言
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 肺泡巨噬细胞
• 1.3 粉尘
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要仪器设备及实验材料
• 1.6 溶液的配制
• 1.6.1 D-Hank’s平衡液的配制
• 1.6.2 DMEM培养基的配制
• 1.6.3 粉尘工作液的配制
• 1.6.4 MTT溶液的配制（5mg/ml）
• 1.6.5 0.25%胰蛋白酶溶液的配制
• 1.6.6 RNA提取试剂的配制
• 1.6.7 Western blot试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 肺泡巨噬细胞的提取和纯化
• 2.2 MTT法确定粉尘作用于肺泡巨噬细胞的剂量
• 2粉尘工作液对肺泡巨噬细胞剂量的确定'>2.2.1 游离SiO₂粉尘工作液对肺泡巨噬细胞剂量的确定
• 2.2.2 煤尘工作液对肺泡巨噬细胞作用剂量的确定
• 2.2.3 氧化锌粉尘工作液对肺泡巨噬细胞作用剂量的确定
• 2.3 巨噬细胞的处理
• 2粉尘作用于肺泡巨噬细胞'>2.3.1 游离SiO₂粉尘作用于肺泡巨噬细胞
• 2.3.2 煤尘作用于肺泡巨噬细胞
• 2.3.3 氧化锌粉尘作用于肺泡巨噬细胞
• 2.4 RT-PCR技术检测肺泡巨噬细胞表面清道夫受体MARCO mRNA的表达水平
• 2.4.1 细胞内总RNA的提取
• 2.4.2 总RNA质量鉴定及含量计算
• 2.4.3 cDNA第一链的合成
• 2.4.4 引物的设计与合成
• 2.4.5 Real-time PCR反应体系
• 2.4.6 PCR反应条件
• 2.5 总蛋白提取及蛋白含量的检测
• 2.5.1 总蛋白提取
• 2.5.2 标准曲线的绘制
• 2.5.3 待测样品蛋白浓度的测定
• 2.6 Western blot检测肺泡巨噬细胞表面MARCO受体的蛋白表达量
• 2.6.1 凝胶的制备
• 2.6.2 上样
• 2.6.3 电泳
• 2.6.4 转膜
• 2.6.5 染色
• 2.6.6 封闭
• 2.6.7 抗体孵育
• 2.6.8 ECL发光
• 2.6.9 曝光
• 2.6.10 条带分析
• 2.7 统计学分析
• 结果
• 1 肺泡巨噬细胞的体外培养形态
• 2 不同粉尘刺激对肺泡巨噬细胞活性的影响
• 2粉尘对肺泡巨噬细胞活性的影响'>2.1 游离SiO₂粉尘对肺泡巨噬细胞活性的影响
• 2.2 煤尘对肺泡巨噬细胞活性的影响
• 2.3 氧化锌粉尘对肺泡巨噬细胞活性的影响
• 3 肺泡巨噬细胞总RNA提取的结果
• 4 不同粉尘刺激对肺泡巨噬细胞表面MARCO受体mRNA表达的影响
• 5 不同粉尘对肺泡巨噬细胞表面MARCO受体蛋白表达的影响
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 个人简历及硕士研究生期间发表论文
• 致谢