论文摘要
脂肪酶（lipase E.C.3.1.1.3）是一类甘油三酯水解酶,可以催化多种反应,在工业中应用广泛。游离脂肪酶在工业生产中不可回收重复利用,浪费严重。目前纳米四氧化三铁材料的工业合成技术成熟,如果对其加以修饰改性,用于固定化脂肪酶,可在外加磁场下实现快速分离,能在工业生产中重复使用,有效节约成本。利用工业生产的纳米四氧化三铁材料为磁原料,分别用γ-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、十六烷基三甲氧基硅烷作修饰剂,通过直接接臂修饰的方法制备了Fe3O4-APTES氨基磁性纳米载体和Fe3O4–十六烷基疏水性纳米载体;以正硅酸乙酯（TEOS）、γ-氨丙基三乙氧基硅烷为单体,分别通过先包埋再接臂的方法和共聚包埋的方法制备了Fe3O4/SiO2–APTES氨基磁性纳米载体和MNC氨基磁性复合载体;以壳聚糖为包埋剂,以戊二醛作双功能偶联剂,通过反相悬浮交联技术包埋纳米四氧化三铁,制备了Fe3O4/CS磁性复合载体。通过电子投射显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）、X-射线衍射仪（XRD）、振动样品磁强计（VSM）分别对上述载体进行表征分析,实验表明,Fe3O4-APTES、Fe3O4–十六烷基载体的粒径大小均一,约为20nm,球形结构,分散性良好,同时表面具有相应的修饰基团,磁性基本没有改变,比饱和磁化强度分别为47.59emu/g、45.74emu/g,具有超顺磁性;Fe3O4/SiO2–APTES载体粒径稍有增加,但仍属于纳米范畴,分散性好,表面具有氨基基团,磁性有所减小,比饱和磁化强度为32.94emu/g,具有超顺磁性;Fe3O4/CS与MNC载体为粒径较大,分散好,表面具有所修饰的基团,比饱和磁化强度下降较大,分别为10.76emu/g、15.16emu/g,但仍具有超顺磁性。上述合成的五种酶载体在分别活化后,进行了脂肪酶CRL的初步固定化实验,结果表明,利用MNC氨基磁性复合载体制备固定化脂肪酶,所得固定化脂肪酶活力最高,固定化效率较高。结合MNC载体合成的产量相对最高,我们选择MNC载体作脂肪酶CRL的固定化研究,优化分析了脂肪酶CRL的固定化条件,主要研究了单位载体的给酶量、固定化时间、固定化温度对固定化效率和固定化酶活力的影响,通过单因素实验分析,获得了优化后的最佳固定化实验条件。在固定化反应体系pH7.0的条件下,单位载体的给酶量为75mg/g,机械搅拌固定化时间为1.5h,固定化体系温度为20℃,脂肪酶的固定化效率为63.8%,固定化脂肪酶的活力为32.48KU/g。以最佳固定化条件制备的固定化酶为样品,以聚乙烯醇橄榄油乳化液为模式底物,对固定化脂肪酶酶促反应的最佳条件进行了考察,确定了固定化脂肪酶CRL的性能指标。实验表明,固定化脂肪酶CRL的最佳催化温度为45℃;最佳催化pH为7.0;重复催化水解底物8次后,其剩余活力为83.7%,具有优良的重复使用性;在4M尿素浓度下,催化水解底物的相对酶活高达78.1%。与游离脂肪酶相比,固定化脂肪酶的最适温度升高5℃,最适pH升高0.5个单位,对温度和变性剂尿素的耐受力得到了明显的提高,重复使用性好,为今后工业应用提供了参考。