小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）快速检测体系的建立及应用

论文摘要

小肠结肠炎耶尔森菌是一种人畜共患病病原菌,主要寄生于健康猪的咽喉部位,可以通过食品等途径传染给人,导致食物中毒,对人类造成很大的威胁。本论文先通过普通PCR方法的建立确定特异性较高的引物,再通过对小肠结肠炎耶尔森菌前增菌液的选择确定样品中本菌的增菌方法,最后再利用内部扩增质控技术通过一系列试验建立小肠结肠炎耶尔森菌实时荧光PCR检测体系,为鲜肉中小肠结肠炎耶尔森菌快速检测提供有效的技术手段和方法。本文分三部分进行研究阐述。1.小肠结肠炎耶尔森菌普通PCR反应的建立本试验根据小肠结肠炎耶尔森菌的ail基因进行三对普通PCR反应引物的选择、特异性、灵敏性,以及反应的退火温度试验。同时将毒力基因ail与16s rDNA组合进行双重PCR反应。最后通过实时荧光PCR反应进行进一步验证。试验结果表明ail1引物特异性较高,灵敏性好,是本菌进行PCR扩增的适宜引物。2.小肠结肠炎耶尔森菌前增菌方式的选择小肠结肠炎耶尔森菌作为一种食源性致病菌逐渐引起了关注。本实验利用胰蛋白胨培养基、改良磷酸盐缓冲液和氯苯酚-替卡西林-氯酸钾培养基分别对小肠结肠炎耶尔森菌前增菌,并采用实时荧光PCR方法对增菌效果进行检验。结果表明：在纯菌体系中胰蛋白胨培养基对小肠结肠炎耶尔森菌的增菌作用优于其他两种培养基,并且增菌24h后即可检测到该菌。在混菌体系中小肠结肠炎耶尔森菌经过改良磷酸盐缓冲液增菌后灵敏性最高,并且增菌时间可缩短至8h。因此在实际检测中可采用改良磷酸盐缓冲液对本菌进行增菌检测。3.小肠结肠炎耶尔森菌实时荧光PCR方法的建立本试验利用小肠结肠炎耶尔森菌的毒力基因ail作为目的基因进行小肠结肠炎耶尔森菌实时荧光PCR反应,并且以大米的gos基因作为内部扩增质控基因进行小肠结肠炎耶尔森菌的双重实时荧光PCR方法的建立。利用建立的双重实时荧光PCR方法对从屠宰场取样的32份下颚淋巴结和38份舌头及扁桃体进行检测。试验结果表明,单重和双重实时荧光PCR方法特异性均较高,检测限分别为10pg/μL和100pg/μL。在实际样品检测时传统生化培养鉴定方法检出率为5.71%,单重和双重实时荧光PCR方法检出率分别为44.29%和8.57%。双重实时荧光PCR方法中各样品的内控基因均有扩增曲线产生,这说明该反应中无抑制PCR物质存在。所有传统方法检出样品均被实时荧光PCR方法检出,这说明本方法检出时间快且检出率高。综上所述,本文选择出一对特异性较高的小肠结肠炎耶尔森菌引物,通过试验结果证明PSB为检测实际样品时增菌效果较好的培养基,最后成功地建立了结合内部扩增质控系统的小肠结肠炎耶尔森菌实时荧光PCR反应体系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 引言
• 文献综述
• 1 小肠结肠炎耶尔森菌
• 1.1 生物学特性
• 1.2 生物学分型
• 1.3 流行病学
• 1.3.1 致病机制
• 1.3.2 致病基因
• 1.3.3 传染源
• 1.3.4 发病症状
• 1.4 食品卫生学意义
• 2 小肠结肠炎耶尔森菌的前增菌方法
• 3 小肠结肠炎耶尔森菌分子生物学检测方法
• 3.1 普通PCR方法
• 3.2 实时荧光PCR（Real-time PCR）
• 3.3 内部扩增质控（Internal Amplification Control,IAC）技术
• 参考文献
• 第一章 小肠结肠炎耶尔森菌普通PCR反应的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基及主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 标准菌株的培养
• 1.2.2 基因组DNA提取
• 1.2.3 引物的选择
• 1.2.4 普通PCR反应
• 1.2.5 双重PCR反应
• 2 结果与分析
• 2.1 单重普通PCR反应
• 2.1.1 特异性及引物浓度试验
• 2.1.2 退化温度的选择
• 2.1.3 灵敏性反应
• 2.2 双重PCR反应
• 2.2.1 引物浓度比例的选择
• 2.2.2 退火温度的选择
• 2.2.3 双重PCR灵敏性反应
• 2.3 实时荧光PCR
• 3 讨论
• 4.本章小结
• 参考文献
• 第二章 小肠结肠炎耶尔森菌前增菌方法的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.1.1 菌种及主要试剂
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 前增菌培养
• 1.2.2 DNA提取
• 1.2.3 普通PCR反应
• 1.2.4 实时荧光PCR反应
• 2 结果与分析
• 2.1 传统培养方法
• 2.2 普通PCR反应结果
• 2.3 实时荧光PCR反应结果
• 3 讨论
• 4.本章小结
• 参考文献
• 第三章 小肠结肠炎耶尔森菌实时荧光PCR方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 纯培养及DNA提取
• 1.2.2 单重实时荧光PCR
• 1.2.3 内部扩增质控反应
• 1.2.4 SYBR GREEN染料法双重实时荧光PCR
• 1.2.5 Taqman探针法实时荧光PCR反应
• 1.2.6 实际样品检验
• 2 结果与分析
• 2.1 单重实时荧光PCR
• 2.1.1 引物浓度
• 2.1.2 特异性
• 2.1.3 灵敏性实验
• 2.2 内部扩增质控反应
• 2.2.1 干扰性试验
• 2.2.2 大米模板浓度
• 2.2.3 大米引物浓度
• 2.3 SYBR GREEN实时荧光PCR
• 2.3.1 双重反应扩增试验
• 2.3.2 SYBR GREEN双重特异性
• 2.4 Taqman探针法实时荧光PCR
• 2.4.1 Taqman探针法灵敏度
• 2.4.2 Taqman探针法特异性
• 2.4.3 人工布菌样品检测
• 2.4.4 实际样品检测
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 附图
• 致谢
• 攻读学位期间发表文章