产1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建

论文摘要

1, 3-丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一,其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1, 3-丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法,由于从自然界中筛选的微生物厌氧发酵甘油生产1, 3-丙二醇还存在产物浓度低、生产周期长和转化率低等问题,目前仅有化学合成法应用于工业生产。因此,利用基因工程技术构建高产菌株备受国内外研究者青睐,被认为是今后的发展方向。以甘油为底物转化生产1, 3-丙二醇的生物合成途径中,由于NADH的不足,抑制了1, 3-丙二醇氧化还原酶的活性,引起3-羟基丙醛累积,进而能抑制甘油脱水酶的活性,从而阻止了菌体的生长和产物1, 3-丙二醇的生成,严重影响1, 3-丙二醇产量的提高。为了解决这一矛盾,本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克隆1.16 kb的1, 3-丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD及2.80 kb来源于克雷伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建了重组菌Escherichia coli （E. coli） JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD）。并对E.coli JM109（pEtac）、重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD）发酵甘油生产1, 3-丙二醇的性能进行了初步考察。结果表明,E. coli JM109（pEtac）不能利用甘油合成1, 3-丙二醇,而重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD）能利用甘油转化为1, 3-丙二醇。对重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD）进行酶活测定,结果发现,重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD）甘油脱水酶酶活力为15 U/mg蛋白,而1, 3-丙二醇氧化还原酶同工酶酶活力为10 U/mg蛋白,而在对照菌株（pEtac）中只能检测到1, 3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活,酶活力为4 U/mg。在构建了可利用NADPH为辅酶的重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD）的基础上,为进一步加强1, 3-丙二醇氧化还原酶的表达以减少3-羟基丙醛累积,故以克雷伯氏菌染色体DNA为模板克隆得到dhaT基因,并表达载体pUC-tac-dhaT,同时与重组质粒pEtac-dhaB-tac-yqhD共转化E. coli JM109,得到稳定的重组大肠杆菌双质粒系统,使大肠杆菌可利用两种辅酶（NADH、NADPH）将甘油转化为1, 3-丙二醇。对重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD,pUC-tac-dhaT）进行酶活测定,结果发现,重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD,pUC-tac-dhaT）甘油脱水酶酶活力为23 U/mg蛋白,而1, 3-丙二醇氧化还原酶同工酶酶活力为12 U/mg蛋白,1, 3-丙二醇氧化还原酶活力为6U/mg。对重组菌的酶活测定结果表明,串联1, 3-丙二醇氧化还原酶dhaT的甘油脱水酶酶活力显著提高。对重组菌E. coli JM109进行发酵试验,在含甘油50 g/L的发酵培养基中,重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD）与重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD,pUC-tac-dhaT）经诱导后1, 3-丙二醇的产量分别为1.52g/L及1. 86 g/L。发酵结果表明,重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD,pUC-tac-dhaT）比E. coli JM109（pEtac-dhaB -tac-yqhD）1, 3-丙二醇的产量提高了22.3%。通过正交分析法优化了重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD,pUC-tac-dhaT）的发酵培养基,其适宜的组成为:甘油20g/L、VB12 0.01 g/L、KH2PO4 7.5 g/L、Mg2+ 0.67 g/L和酵母膏5 g/L,重组菌E. coli JM109（pEtac-dhaB-tac-yqhD,pUC-tac-dhaT）在此培养基中1, 3-丙二醇的产量达到2.25 g/L。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 1, 3-丙二醇的性质及应用领域
• 1.3 1, 3-丙二醇的生产及市场情况
• 1.4 1, 3-丙二醇的生产方法
• 1.5 微生物发酵法生产1, 3-丙二醇的研究进展
• 1.5.1 生产菌种
• 1.5.2 1, 3-丙二醇生物合成途径
• 1.5.3 基因工程研究
• 1.5.4 国内外微生物法合成1, 3-丙二醇研究现状
• 1.6 展望
• 1.7 立题意义和本论文的研究内容
• 1.7.1 立题意义
• 1.7.2 研究内容
• 第二章 大肠杆菌JM109（PETAC-DHAB-TAC-YQHD）的构建及其表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 1, 3-丙二醇氧化还原酶同功酶yqhD 的克隆及核苷酸序列分析
• 2.3.2 甘油脱水酶基因dhaB 的克隆及核苷酸序列分析
• 2.3.3 重组大肠杆菌表达载体pEtac-dhaB-tac-yqhD 的构建
• 2.3.4 重组菌（pEtac-dhaB-tac-yqhD）全细胞蛋白SDS-PAGE 电泳分析
• 2.3.5 重组菌（pEtac-dhaB-tac-yqhD）质粒稳定性
• 2.3.6 转化子发酵产1, 3-丙二醇的能力
• 2.3.7 酶活力分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 重组质粒PUC-TAC-DHAT 的构建及其与PETAC-DHAB-TAC-YQHD 在大肠杆菌JM109 中共表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 1, 3-丙二醇氧化还原酶dhaT 的克隆及核苷酸序列分析
• 3.3.2 大肠杆菌表达载体pUC19-tac-dhaT 的构建
• 3.3.3 质粒pEtac-dhaB-tac-yqhD 和pUC-tac-dhaT 共转化大肠杆菌JM109
• 3.3.4 重组菌（pEtac-dhaB-tac-yqhD，pUC-tac-dhaT）全细胞蛋白SDS-PAG 电泳分析
• 3.3.5 重组菌（pEtac-dhaB-tac-yqhD，pUC-tac-dhaT）质粒稳定性
• 3.3.6 酶活力分析
• 3.3.7 对1, 3-丙二醇累积及生物量的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组菌E. COLI JM109（PETAC-DHAB-TAC-YQHD，PUC-TAC-DHAT）发酵培养基优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 培养基和培养条件
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 初始葡萄糖浓度对重组菌发酵的影响
• 4.3.2 初始甘油浓度对重组菌发酵的影响
• 4.3.3 酵母膏浓度对重组菌发酵的影响
• 4.3.4 磷酸二氢钾浓度对重组菌发酵的影响
• 2+浓度对重组菌发酵的影响'>4.3.5 Mg²⁺浓度对重组菌发酵的影响
• 12 浓度对重组菌发酵的影响'>4.3.6 维生素B₁₂浓度对重组菌发酵的影响
• 4.3.7 摇床转速与装液量
• 4.3.8 接种量
• 4.3.9 IPTG 加入时间与加入量
• 4.3.10 正交实验设计优化重组菌的发酵培养基
• 4.4 本章小结
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士期间发表的论文