应用RNAi研究大豆β-伴大豆球蛋白基因的表达与调控

论文摘要

RNA干涉（RNA interference，RNAi）是一种双链RNA分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默。具有发夹结构（hairpin RNA，hpRNA）的RNA干扰载体因其高效性和特异性已广泛应用于植物基因功能的研究。大豆种子贮藏蛋白基因表达的调控主要发生在转录水平和转录后水平上。因此，我们拟构建β-伴大豆球蛋白α亚基基因的RNAi载体，并进行大豆转化，以此对大豆11S与7S的调控机制进行初步探讨。根据大豆β-伴大豆球蛋白α亚基基因序列（GenBank No．AB051865）设计特异性引物，用PCR法从南农99-10大豆总基因组中扩增出β-伴大豆球蛋白α亚基基因（CG-3），将该基因插入到植物表达载体pBI121的35S启动子和GFP基因之间，该基因与GFP基因构成融合表达基因，构建成α亚基基因过量表达的植物双元载体（pYXP7SαG）；用PCR法从南农99-10大豆总基因组中扩增出α亚基基因部分片段，该片段包含α亚基基因5′端部分非翻译序列（UTR）、第一个外显子和第一个内含子。然后再用PCR法扩增α亚基基因5′端第一个外显子的部分序列，将这两个基因片段反向连接，插入到植物表达载体pBI121的35S启动子和nos终止子之间，构建成可转录表达出发夹RNA（hpRNA）结构的α亚基基因的RNA干扰表达载体（pYXP7SαRi）。本研究以农杆菌介导的大豆子叶节转化系统为技术平台，以栽培大豆南农88-1、豫豆23、南农87C-38和南农18-6的子叶节为外植体，用EHA105农杆菌（含pYXP7SαG质粒）对这四个不同基因型的大豆进行转化，研究了巯基混合物对大豆子叶节转化的影响。结果表明，巯基混合物对南农88-1，南农18-6，豫豆23的转化率均有提高，但对南农87C-38几乎无影响。其中南农88-1的转化率有明显的提高，在共培养基中加入单一的巯基化合物（半胱氨酸），其转化率为1.39％；在共培养基中加入巯基混合物（半胱氨酸、二硫苏糖醇和硫代硫酸钠），其转化率达到2.20％。同时应用优化的大豆子叶节转化系统，以栽培大豆南农88-1、豫豆23、南农87C-38、南农18-6、巴马九月黄、启东羊眼豆和常熟散子黄豆的子叶节为外植体，用EHA105农杆菌（含pYXP7SαRi质粒）对7个不同基因型的大豆进行转化，结果表明，不同基因型大豆之间的转化存在着明显差异。在本实验范围内转化率比较高的是南农88-1、南农18-6及豫豆23。同时筛选出了一个子叶节再生性较好的基因型，即巴马九月黄。对所有转基因植株经Southern分析鉴定，共获得大豆转基因植株21株。正常发育并收获种子的转基因大豆13株，其中过量表达α亚基基因的转基因大豆5株，RNA干扰α亚基基因的转基因大豆8株。经RT-PCR和Northern分析鉴定，RNA干扰的转基因大豆中的α亚基（CG-3）部分被抑制。应用蛋白质组学方法对未转化大豆南农88-1、α亚基基因过量表达的转基因大豆及转RNAi的转基因大豆种子的差异表达情况进行了研究。在双向电泳pH4-7的胶上，用PDQuest软件分析表达量变化2倍以上的蛋白点，选取25个蛋白丰度表现明显差异的蛋白点进行胶内酶解，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定均获得肽质量指纹图谱。从大豆的UniGene库中鉴定出20个蛋白，根据功能的不同，将这20个差异蛋白分属为5个功能类群。①贮藏蛋白(大豆β-伴大豆球蛋白α亚基、大豆球蛋白A1aB（1b）亚基前体和大豆球蛋白A3B4亚基)；②细胞分裂与生长相关蛋白（成熟相关蛋白、种子成熟蛋白PM22和PM32、68kDa LEA蛋白等）；③与运输相关的蛋白（糖结合蛋白同源S-64）；④与抗性相关蛋白（HSP70）；⑤与转录相关蛋白（RNA结合蛋白）。分析结果表明，RNAi介导大豆β-伴大豆球蛋白（7S）基因表达降低而引起大豆球蛋白（11S）的GY2和GY5基因表达量增加，这证明大豆11S与7S存在一种补偿机制，即11S蛋白含量可补偿7S蛋白含量的降低。同时对参与这一补偿机制的其它蛋白可能的作用进行了讨论。对未转化大豆南农88-1、α亚基基因过量表达的转基因大豆及转RNAi的转基因大豆种子的氨基酸含量分析表明，其总氨基酸含量基本无变化。研究证明编码种子贮藏蛋白的基因是多基因家族，它们在种子中的表达具有高度的发育专一性和组织特异性。因此，种子特异性启动子对于种子贮藏蛋白基因表达调控机制的研究具有十分重要的意义。本研究通过PCR技术从三个栽培大豆（南农99-10、N2899和南农88-1）和两个野生大豆（江浦野生豆-1和ZYD4174）的基因组中分离到大豆β-伴大豆球蛋白α亚基基因启动子片段（7SαP），序列分析表明：7SαP片段包含多个种子特异性启动子所特有的序列元件，如RY重复序列元件、ACGT序列元件、AGCCCCA序列元件和A／T富含序列元件等，而这五个大豆材料的7SαP序列的同源性达99％。将从南农99-10中克隆的7SαP片段与pBI121-GFP连接构建表达载体，经农杆菌介导的花浸染方法转化拟南芥。Southern结果显示，7SαP片段和报告基因GFP以单拷贝的形式整合到拟南芥基因组中，转基因拟南芥中的GFP检测表明，GFP基因在启动子片段7SαP驱动下获得了种子特异性表达，为进一步在分子水平上研究种子贮藏蛋白的表达调控和应用基因工程有效地对大豆品质进行遗传改良奠定了基础。

论文目录

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英文摘要

缩略词表及其英汉对照

第一部分文献综述

第一章大豆种子贮藏蛋白的研究进展

1 大豆种子贮藏蛋白组成

1.1 11S大豆球蛋白

1.2 7S β-伴大豆球蛋白

1.3 2S大豆球蛋白

2 大豆种子贮藏蛋白的合成和积累

2.1 大豆种子贮藏蛋白的合成及运输

2.2 大豆种子贮藏蛋白的积累

3 大豆种子贮藏蛋白基因结构与表达调控

3.1 大豆贮藏蛋白基因结构

3.2 大豆种子贮藏蛋白基因的表达调控

3.3 大豆种子贮藏蛋白基因工程研究

第二章 RNA干涉的研究进展

1 RNA干涉的历史和研究进展

2 RNAi的特征

3 RNAi的作用机制

4 RNAi的生物学意义

5 RNAi技术在植物生物学中的应用

5.1 植物功能基因组的研究

5.2 作物的品种改良

5.3 其它的应用

6 RNAi技术存在问题及展望

第三章大豆遗传转化的研究进展

1 大豆遗传转化中常用的转基因方法

1.1 农杆菌介导法

1.2 基因枪（微粒轰击）法

1.3 农杆菌介导法和基因枪法的优点及缺点

2 报告基因的研究进展

2.1 nos和ocs报告基因

2.2 β-葡萄糖苷酸酶报告基因

2.3 荧光素酶报告基因

2.4 绿色荧光蛋白报告基因

3 大豆遗传转化的主要障碍及可能的解决途径

第四章高等植物启动子研究进展

1 启动子的概念、结构及分类

1.1 启动子的概念

1.2 高等植物启动子的结构

1.3 启动子分类及特点

2 启动子克隆的意义及其克隆方法

2.1 启动子克隆的意义

2.2 启动子克隆的方法

3 种子特异性启动子的研究

4 展望

本研究目的和意义

第二部分研究内容

第五章大豆β-伴大豆球蛋白α-亚基基因RNAi载体的构建

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 大豆β-伴大豆球蛋白α亚基基因的克隆

2.2 大豆β-伴大豆球蛋白α亚基基因序列比对分析

2.3 α亚基基因表达载体的构建

2.4 α亚基基因RNAi表达载体的构建

2.5 表达载体导入根癌农杆菌

3 讨论

第六章农杆菌介导大豆子叶节遗传转化

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 不同大豆品种对卡那霉素的敏感性

2.2 质粒pYXP7S α G的大豆遗传转化

2.3 质粒pYXP7S α Ri的大豆遗传转化

2.4 转基因植株PCR鉴定

2.5 转基因植株Southern blot鉴定

2.6 转基因植株表型观察

2.7 RT-PCR半定量分析

2.8 Northern blot鉴定

3 讨论

3.1 大豆遗传转化分析

3.2 转基因植株的检测

3.3 RNAi抑制效率的分析

第七章 RNAi抑制大豆β-伴大豆球蛋白α-亚基的差异蛋白质组分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 转基因大豆成熟种子的差异蛋白质组分析

2.2 转基因大豆种子总氨基酸含量分析

3 讨论

3.1 转基因大豆种子贮藏蛋白的变化

3.2 参与11S与7S调控的相关蛋白的功能推测

3.3 转基因大豆种子的氨基酸含量分析

第八章大豆β-伴大豆球蛋白基因启动子的克隆及功能分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 栽培大豆与野生大豆α亚基基因启动子片段的克隆

2.2 α亚基基因启动子片段序列分析

2.3 表达载体的构建

2.4 农杆菌转化与转基因拟南芥的获得

2.5 转基因拟南芥的Southern blot分析

2.6 种子特异性表达的鉴定

3 讨论

全文结论

本研究创新之处

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的论文

致谢

应用RNAi研究大豆β-伴大豆球蛋白基因的表达与调控

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