论文摘要
蛋白质与酶等在生物体的各种生命活动中发挥着重要的作用,蛋白质的研究对指导工业生产,对了解生命的规律和医药实践也有重要的理论及实践意义,然而研究蛋白质的这些作用首先要成功的实现蛋白的分离纯化,因此蛋白质的分离纯化的研究具有重要意义。生物吸附法因方法简单、成本低等优点而被广泛关注。啤酒废酵母菌是酿酒产业产生的废弃物,但它和活菌体表面含有相同的官能团,是一种天然的生物吸附剂,由于自身粒径小、吸附容量较低且不利于两相分离等缺点,限制了其广泛应用。本文采用化学修饰的方法,将一系列含有羧基的小分子修饰到啤酒废酵母菌表面,制备了新的生物吸附剂,并对他们进行各种表征,研究了修饰菌对溶菌酶、牛血红和牛血清蛋白的吸附性能。具体工作如下:1.将丁二酸酐修饰到啤酒废酵母菌表面,通过改变投料比和反应介质,发现丁二酸酐修饰啤酒废酵母菌时用料比为1:3（酵母菌:丁二酸酐）且介质为吡啶时,接枝率高达41.3%,并通过红外和XPS谱对修饰菌进行表征,结果发现丁二酸酐已成功修饰到啤酒废酵母菌表面。丁二酸酐修饰菌对溶菌酶的最佳吸附条件为30℃、6 h、pH 7.0。在最佳吸附条件下,修饰菌和未修饰菌的最大吸附容量分别为848.0 mg g-1和102.0 mg g-1,修饰菌是未修饰菌的8.3倍,用Langmuir和Freundlich模型对吸附等温线进行模拟,发现修饰菌对溶菌酶的吸附过程更符合Langmuir吸附等温模式,属单分子层吸附模式。以1.0 mol L-1 pH 7.0的NaSCN溶液为洗脱液,洗脱率高达94.2%。将该吸附剂用于从鸡蛋清中提取溶菌酶,并对酶活力进行测定,得活力保持率为91.5%,总活力收得率为81.5%,纯化倍数为35.1。电泳分析表明纯化后的溶菌酶具有较高的纯度。2.以过硫酸钾为热引发剂,将聚α-甲基丙烯酸修饰在酵母菌表面,并通过扫描电镜、红外、XPS谱对修饰菌进行表征,用电位滴定法测定了菌体表面的官能团含量为1.4 m mol g-1,说明聚α-甲基丙烯酸已成功修饰到啤酒废酵母菌表面。将其作为吸附剂,以溶菌酶为吸附对象,确定吸附的最佳条件为30℃、6 h、pH 7.0。在最佳吸附条件下,修饰菌和未修饰菌的最大吸附容量分别为545.0 mg g-1和102.0 mg g-1,前者是后者的5.3倍。用Langmuir和Freundlich吸附模型对溶菌酶的吸附等温线进行模拟,发现未修饰符合Langmuir模型,而修饰菌则不符合,可能是吸附剂表面聚合物大分子对吸附的影响所致。以1.0 mol L-1 pH 7.0的NaSCN溶液为洗脱液,洗脱率最高为96.9%。用于实际样品鸡蛋清中溶菌酶的提取,发现从鸡蛋清中提取溶菌酶的总活力保持率为79.6%,收得率为84.0%,纯化倍数为27.1。3.将丁二酸酐修饰啤酒废酵母菌用于吸附牛血红蛋白和牛血清白蛋白的研究,实验发现对牛血红蛋白的最佳吸附条件为10 h、pH 5.4、25℃,最大吸附容量为566.2 mg g-1,是未修饰菌(23.5 mg g-1)的24.1倍。用Langmuir和Freundlich模型对两种蛋白的吸附等温线进行模拟,发现修饰菌对牛血红蛋白的吸附过程更符合Langmuir吸附等温模式,表明牛血红的吸附是以单分子层吸附为主。以pH 8.0,1.0 mol L-1NaCl的Tris-HCl缓冲溶液为洗脱液,洗脱率达到60%,将其用于新鲜牛血的样品处理,发现通过二次吸附和洗脱可将洗脱率提高至98.4%,从牛血处理液中纯化牛血红蛋白,纯化前牛血处理液中BHb占总蛋白的百分比为36.3%,纯化后为91.5%,富集倍数为2.52。4.以聚α-甲基丙烯酸修饰啤酒废酵母菌为吸附剂,对牛血红蛋白和牛血清白蛋白的吸附进行研究,实验发现对牛血清白蛋白几乎不吸附,而在24 h、pH 5.4、25℃条件下,对牛血红蛋白的最大吸附容量为244.6 mg g-1,是未修饰菌的10.4倍,用Langmuir和Freundlich模型对两种蛋白的吸附等温线进行模拟,发现修饰菌对牛血红的吸附过程更符合Langmuir吸附等温模式,表明牛血红的吸附是以单分子层吸附为主。以pH 8.0,1.0 mol L-1NaCl的Tris-HCl缓冲溶液为洗脱液,洗脱率为62.1%,从牛血处理液中纯化牛血红蛋白时,二次洗脱率提高至88.6%,纯化前后牛血处理液中BHb占总蛋白的百分比分别为36.3%和78.7%,富集倍数为2.17。