论文摘要
目的缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的常见病和多发病,其病理过程涉及复杂的时间和空间级联反应,虽然对其机制的了解越来越深入,但有效的治疗手段仍然缺乏。碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）是一种有效的神经营养因子和血管活性多肽。具有多种生物学活性,能促进神经元的存活及突起生长,是神经胶质细胞、毛细血管内皮细胞的促分裂原,并能拮抗兴奋性氨基酸等多种有害物质对神经元的毒性作用而保护神经元.近年研究提示成年哺乳动物脑内存在神经干细胞（neural stem cell,NSC）,其主要位于侧脑室下区和海马齿状回颗粒下区。这是神经科学领域的重大发现,为目前一些棘手的神经系统疾病如神经变性病、遗传病及严重的脑血管病的治疗带来希望。因为其具有终身自我更新能力及多分化潜能,在治疗神经系统多种疾病中拥有巨大潜力,尤其在脑血管病的替代治疗方面更具有优越性,为神经系统疾病的治疗提供了新的思路。神经干细胞的增殖和分化受到多种因素的调控。Wnt信号分子在胚胎发育中可指导细胞的命运,在多种成体组织如肌肉、造血系统中也被证实具有促进原始细胞增殖的作用。为了揭示神经干细胞的调控机制,阐明其如何保持自我更新,本研究选用局灶性脑缺血再灌注模型,观察脑缺血再灌注后皮质及海马形态学的改变及bFGF的保护作用,采用BrdU标记分裂细胞观察海马神经发生的时间规律。检测脑缺血激活内源性神经干细胞过程中Wnt/β-catenin信号分子的变化,初步探索Wnt信号途径与神经干细胞增殖分化的关系以及bFGF干扰作用。材料和方法1、局灶性脑缺血再灌注模型的制备:健康雄性wistar大鼠,质量250-300g。随机分为3组:假手术组（sham组）,缺血再灌注组（I/R组）,bFGF组。用线栓法建立大脑中动脉闭塞（middle cerebral arteryoc clusion,MCAO）模型。sham组除不插线外,余同手术组,术后观察右侧Horner’s征和左侧肢体瘫痪体征以判断模型是否成功。2、HE染色及电镜观察局灶性脑缺血再灌注后皮质及海马神经元的形态学改变。3、免疫组织化学检测局灶性脑缺血再灌注后皮质及海马c-Myc蛋白的表达,TUNEL法检测神经元的凋亡及bFGF的干预。4、BrdU标记及免疫组织化学检测局灶性脑缺血再灌注后海马神经干细胞不同时间点的增殖规律及bFGF的干预。。5、利用Western Blot、RT-PCR检测局灶性脑缺血再灌注后海马Wnt-1、β-catenin蛋白和基因表达情况。6、免疫组织化学、原位杂交检测局灶性脑缺血再灌注后皮质及海马神经元β-catenin蛋白和基因表达的情况及bFGF的干预。实验结果1、HE染色结果:光镜下I/R组可见大量神经元变性坏死,呈现胞体皱缩,变形,核固缩,胞浆浓缩呈深伊红染色,间质水肿明显。bFGF组多数神经元结构较完整,形态相对正常,间质水肿轻。2、电镜观察结果:sham组大鼠海马神经元核比较大、呈圆形或椭圆形,核膜清晰、完整,胞质内细胞器丰富,结构清晰。I/R组可见核染色较深,核仁增大且致密,胞质水肿,线粒体肿胀、嵴断裂,基质电子密度增高,粗面内质网脱颗粒:轴突内线粒体空泡样变,髓鞘分层、散乱。bFGF组核质电子密度较低,常染色质多,呈细颗粒状,分布较均匀,核仁呈网状,线粒体呈椭圆形或杆状,粗面内质网散在分布。3、TUNEL法原位神经元凋亡检测结果:各组神经元细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。sham组偶见凋亡细胞,I/R组皮质及海马可见较多凋亡细胞,随着bFGF的应用细胞凋亡数下降。4、c-Myc免疫组织化学检测:sham组,皮质及海马神经元内少见c-Myc免疫反应阳性细胞;I/R组,缺血再灌注损伤后皮质及海马神经元内c-Myc阳性表达明显高于假手术组,在神经元胞核内可见大量棕黄色颗粒,其中部分细胞胞质和胞核均可见阳性反应物。bFGF组,皮质及海马神经元内c-Myc表达较I/R组明显减少。5、BrdU免疫组织化学检测:sham组海马仅见少量散在的BrdU阳性细胞。I/R组3d时,BrdU阳性细胞开始增多,大小不一,呈簇状分布,主要分布于SGZ:7d达峰值,除SGZ外门区可见散在的BrdU阳性细胞;21d开始减少,但在颗粒细胞层可见BrdU阳性细胞:与sham组比较,7、14和21d BrdU阳性细胞均明显增多。bFGF组3d时BrdU阳性细胞开始增多,呈簇状分布,随着缺血时间延长BrdU阳性细胞明显增加,7d达峰值21d数量仍处于高水平,门区可见较多散在的BrdU阳性细胞,在颗粒细胞层BrdU阳性细胞增多:与I/R组比较,7、14和21dBrdU阳性细胞均显著增加。6、Western Blot、RT-PCR检测NSC增殖分化相关蛋白基因变化:Western blot检测结果显示:sham组大鼠海马无Wntl的表达,β-catenin轻度表达,脑缺血再灌注3d可检测到Wntl、β-catenin开始增加,Wntl表达在7d时达到高峰,β-catenin在14d时达高峰。21d后Wnt1、β-catenin表达减少。蛋白印迹分析结果与RT-PCR结果显示一致。7、β-catenin免疫组织化学及原位杂交检测:sham组皮质及海马仅见少量阳性细胞。I/R组14d时,与sham组比较,皮质及海马神经元β-catenin蛋白基因表达增多。bFGF组皮质及海马神经元β-catenin蛋白基因表达较I/R组明显增加。结论1、bFGF减少缺血神经元凋亡,对局灶性脑缺血皮质及海马神经元具有保护作用。2、通过BrdU标记,MCAO模型再现了内源性神经干细胞增殖全过程。bFGF促进局灶性脑缺血后内源性神经干细胞的发生。3、根据Wnt-1、β-catenin时间依赖性表达与神经干细胞增殖分化的全过程吻合,说明其在神经干细胞增殖分化中起重要调控作用。4、bFGF促进Wnt通路重要信号分子β-Catenin表达,揭示其促进局灶性脑缺血后神经发生的作用机制。