XA21和PI-D2激酶在酵母系统表达及其自我磷酸化活性研究

论文摘要

水稻是最重要的粮食作物之一，是全世界一半以上人口的主要粮食来源。水稻病害的侵染会导致减产甚至绝收。白叶枯病和稻瘟病是水稻两大主要病害，对抗病基因介导的抗病分子机理研究对水稻生产具有重要的意义。Xa21是第一个克隆的水稻抗病基因，对水稻白叶枯病具有广谱抗性。其编码的蛋白质是一个类受体蛋白激酶。刘国振等对Xa21编码蛋白质的激酶区进行了系统的生化特性的研究，证明了Xa21编码一个有活性的蛋白激酶，是丝／苏氨酸特异的。稻瘟病是真菌性病害，由异宗配合子囊菌Magnaporthe grisea的无性世代PyricμLaria grisea产生的分生孢子侵染而使水稻致病。Pi-d2抗稻瘟病基因最早在水稻品种地谷中发现，并定位在第6号染色体上。经图位克隆法克隆后，发现Pi-d2也编码一个类受体激酶。本试验中，我们将XA21和PI-D2蛋白激酶在真核表达系统酵母中进行了表达。（1）通过酿酒酵母同源重组原理，将目的片断和pEGH载体转化酿酒酵母，PCR验证后诱导表达，纯化后获得了考染可见并具有自我磷酸化活性的蛋白质，为两个蛋白激酶的大量表达，进而开展相关生化分析奠定了基础。（2）利用毕赤酵母表达系统表达XA21和PI-D2蛋白激酶，即利用毕赤酵母分泌型表达载体构建含有目的基因的重组载体，将重组载体转化到毕赤酵母细胞中，通过营养缺陷型筛选和G418、Zeocin抗性筛选后，再通过PCR验证重组载体整合到酵母基因组中的情况，将PER验证过的阳性重组子用甲醇进行诱导表达，最后通过SDS-PAGE及Western Blot检测上清中目的蛋白的表达情况，又进一步优化培养条件，浓缩蛋白质。结果表明：构建的pPICZαA-Xa21、pPICZαA-Pi-d2、pPIC9K-Xa21、pPIC9K-Pi-d2重组质粒，经测序验证正确后，进行线性化，分别转化X33、GS115、KM71毕赤酵母菌株，诱导表达，XA21和PI-D2蛋白激酶在沉淀中检测到，上清未检测到，表明其可能没有分泌到上清。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究意义
• 1.2 蛋白质激酶研究进展
• 1.3 体外表达系统
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 主要试剂及用品
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 试剂配制
• 2.1.4.1 酿酒酵母菌转化培养液配制
• 2.4.1.2 酿酒酵母诱导表达培养液配制
• 2.1.4.3 细菌培养基制备
• 2.1.4.4 毕赤酵母表达常用母液及缓冲液配制
• 2.1.4.5 毕赤酵母表达培养基配制
• 2.1.4.6 冻融法制备毕赤酵母基因组DNA
• 2.1.4.7 Western Blot所用试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 酿酒酵母表达系统
• 2.2.1.1 寡核苷酸引物的设计合成及PCR产物扩增
• 2.2.1.2 第一次PCR产物纯化
• 2.2.1.3 第二次PCR
• 2.2.1.4 第二次PCR产物纯化
• 2.2.1.5 酿酒酵母转化及重组子的验证
• 2.2.1.6 诱导表达及SDS-PAGE检测
• 2.2.1.7 Western检测
• 2.2.1.8 激酶自我磷酸化活性检测
• 2.2.2 毕赤酵母表达系统
• 2.2.2.1 寡核苷酸引物的设计合成
• 2.2.2.2 Xa21和Pi-d2激酶区序列的PCR扩增及纯化
• 2.2.2.3 PCR产物纯化
• 2.2.2.4 载体和目的片断的酶切与连接反应
• 2.2.2.5 连接产物的转化
• 2.2.2.6 重组质粒的鉴定
• 2.2.2.7 重组质粒的测序分析
• 2.2.2.8 转化毕赤酵母
• 2.2.2.9 用PCR方法验证重组载体
• 2.2.2.10 重组基因在酵母中的小量诱导表达
• 2.2.2.11 重组基因在酵母中诱导表达培养条件优化
• 2.2.2.12 不同浓缩方法浓缩蛋白质
• 2.2.2.13 表达产物的分析与鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 酿酒酵母表达系统
• 3.1.1 目的基因的扩增
• 3.1.2 第二次PCR扩增
• 3.1.3 转化酿酒酵母及PCR验证转化子
• 3.1.4 蛋白质诱导表达及Western检测
• 3.1.5 激酶自我磷酸化活性检测
• 3.2 毕赤酵母表达系统
• 3.2.1 目的基因的扩增
• 3.2.2 重组载体构建的鉴定
• 3.2.3 重组载体的测序及结果分析
• 3.2.4 MD平板筛选重组转化子
• 3.2.5 YPD-G418或YPD-Zeocin筛选高拷贝重组转化子
• 3.2.6 PCR鉴定重组转化子
• 3.2.7 SDS-PAGE检测目的蛋白质表达及鉴定
• 3.2.8 Western Blot检测目的蛋白质表达
• 4 讨论
• 4.1 酿酒酵母表达系统
• 4.2 毕赤酵母表达系统
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢