论文摘要
阿片类药物既是药也是毒,其成瘾性是当今全球性亟待解决的严重的健康问题和社会问题。阿片类物质（包含阿片类药物）依赖,包括身体依赖和精神依赖两方面。对于阿片类物质精神依赖,至今尚无有效的防治药物,因此亟待研发新型的戒毒新药。阿片类药物的正性强化效应即奖赏效应,是引起阿片类药物精神依赖并导致强迫性觅药行为和复吸的主要原因。条件性位置偏爱（conditioned place preference, CPP）实验是用于研究阿片类药物等精神活性物质的奖赏效应以及评价药物对其防治作用的常用手段。伏隔核（NAc）在阿片类物质产生奖赏效应中起着重要作用。褪黑素（melatonin, Mel）为体内主要由松果体合成分泌的神经内分泌活性物质,化学结构为N-乙酰-5-甲氧基色胺,现可化学合成。体内尤其脑内存在特异性褪黑素受体,Mel为其内源性配体。分布于细胞膜上的褪黑素受体MT1亚型和MT2亚型已在人和多种动物成功克隆,并找到其特异性阻断剂,如MT1受体和MT2受体非选择性阻断剂luzindole,MT2受体亚型选择性阻断剂K185。以褪黑素为先导化合物,在褪黑素同系物中寻找具有药用价值的活性物质,为目前国内外研发该类新药的发展方向。褪黑素具有某些重要的神经精神药理作用,其功能研究及药用价值探讨为目前国内外研究热点之一。近年来关于褪黑素抗阿片类药物成瘾作用日益受到重视。研究表明,褪黑素可对抗小鼠吗啡身体依赖性形成及戒断症状,但其本身对小鼠无致身体依赖性作用。更令人感兴趣的是褪黑素对阿片类药物精神依赖作用的初步探索研究:黄矛等研究显示褪黑素可显著拮抗小鼠吗啡CPP效应形成;而Yahyavi-Firouz-Abadi等研究则显示,亚有效剂量（sub-effective dose）吗啡合用褪黑素可致小鼠产生显著的CPP效应,但褪黑素本身无致CPP效应。丛斌课题组研究提示褪黑素对大鼠吗啡CPP效应复燃具有抑制作用。提示褪黑素可能具有抗阿片类药物奖赏效应的作用,但其作用及其特点有待于进一步确证。鉴此,本论文首先拟观察褪黑素对大小鼠吗啡诱导的CPP效应的影响,以进一步明确褪黑素抗阿片类药物奖赏效应的作用及其特点,为褪黑素及其同系物可能的戒毒临床应用提供动物学实验依据。褪黑素易于透过血脑屏障,中枢神经系统是其发挥神经精神药理作用的重要部位。通过激动褪黑素受体是褪黑素发挥生理药理效应的重要机制。有关褪黑素抗阿片类药物奖赏效应作用的受体机制有待于研究。因此,本论文接着分析褪黑素抗吗啡奖赏效应作用的作用部位以及介导其作用的褪黑素受体亚型,为防治阿片类物质精神依赖的新药研发提供新的药物作用靶点。有关褪黑素抗阿片类药物奖赏效应作用的分子机制有待于探索。有资料表明,NAc等奖赏相关核团内转录因子CREB和△FosB的表达与激活介导药物成瘾状态不同方面,是阿片类药物等药物成瘾的重要效应分子。为此,本论文最后拟探讨褪黑素抗吗啡奖赏效应作用与NAc等核团脑区内△FosB、CREB以及磷酸化CREB表达的关系,初步探索褪黑素抗吗啡奖赏效应作用的分子机制,为褪黑素及其同系物可能的戒毒临床应用提供理论基础,并有助于深化理解阿片类物质精神依赖的神经生物学机制。1.吗啡诱导的条件性位置偏爱效应模型的建立建立大、小鼠吗啡诱导的条件性位置偏爱模型,观察吗啡诱导的条件性位置偏爱效应表达的维持。小鼠随机分为对照组（伴NS组）和模型组（伴Mor组）,分别给予生理盐水（NS）（10 ml/kg,s.c.）和吗啡（Mor）（3 mg/kg,s.c.）,每天1次,训练5天;训练结束后测定小鼠位置偏爱性,连续测试3天,以小鼠测试阶段在伴药箱中的停留时间减去预测试阶段伴药箱停留时间的基础值即CPP评分作为评价指标。结果显示,模型组小鼠CPP评分显著高于对照组（P < 0.01）,提示小鼠吗啡诱导的CPP模型建立成功,且此效应表达可维持3天以上。大鼠吗啡诱导的CPP模型建立方法与小鼠相似,只是采用Mor（5 mg/kg,s.c.）,训练6天,训练结束后连续2天测定大鼠位置偏爱性。结果表明,模型组大鼠CPP评分显著高于对照组（P < 0.01）,提示大鼠吗啡诱导的条件性位置偏爱模型建立成功,且此效应可维持2天以上。后续实验根据本项实验以及相关文献选择训练结束后的第1天进行测试,以观察褪黑素对吗啡诱导的CPP效应的形成和表达的影响。2.褪黑素对吗啡奖赏效应的作用2.1 i.p.褪黑素对小鼠吗啡诱导的条件性位置偏爱效应形成的影响小鼠同上建立CPP模型,在每天给予Mor同时,各组小鼠分别i.p. Mel以及Mel配药液,观察Mel对小鼠吗啡诱导的CPP效应形成的影响。结果显示,与Mor同时给予高、低剂量Mel（50 mg/kg,25 mg/kg）,小鼠的CPP评分与模型组相比未见显著改变,提示褪黑素对小鼠吗啡诱导的CPP效应的形成可能无影响。另外,我们采取了第二种褪黑素的给药方案。小鼠同上建立CPP模型,自训练第3天开始,在每天给予Mor同时,各组小鼠分别i.p. Mel以及Mel配药液,观察较少给药次数的Mel对小鼠吗啡诱导的CPP效应形成的影响。结果显示,第3天开始与Mor同时给予Mel,小鼠的CPP评分与模型组相比未见显著改变。此结果进一步提示,褪黑素对小鼠吗啡诱导的CPP效应的形成可能无影响。2.2 i.p.褪黑素对小鼠吗啡诱导的条件性位置偏爱效应表达的影响小鼠同上建立CPP模型,于第6天位置偏爱测定前20 min,各组小鼠分别i.p. Mel以及Mel配药液,观察i.p. Mel对小鼠吗啡诱导的CPP效应表达的影响。结果显示,i.p. Mel（25,50 mg/kg）可显著翻转吗啡诱导的CPP评分升高（P < 0.01）,且作用呈剂量依赖性,提示褪黑素可抑制小鼠吗啡诱导的CPP效应的表达。2.3 i.p.褪黑素对大鼠吗啡诱导的条件性位置偏爱效应表达的影响大鼠同1.项建立CPP模型,于位置偏爱测定前20 min,各组大鼠分别i.p. Mel以及Mel配药液,观察i.p. Mel对大鼠吗啡诱导的CPP效应表达的影响。结果表明,i.p. Mel 50 mg/kg可显著翻转吗啡诱导的CPP评分升高（P < 0.01）,且作用随剂量增大而增强,提示褪黑素可抑制大鼠吗啡诱导的CPP效应的表达。2.4褪黑素自身对小鼠条件性位置偏爱效应诱导的观察为明确褪黑素自身是否存在精神依赖性潜力,观察了褪黑素对小鼠条件性位置偏爱效应的诱导。29只小鼠,随机分为对照组（伴NS组）、伴Mor组和伴Mel组。伴Mel组小鼠连续5天给予Mel （50 mg/kg,i.p.）进行Mel伴药训练,其它组伴药训练方案同上,观察褪黑素对小鼠条件性位置偏爱效应的诱导。结果显示,伴Mel训练组小鼠CPP评分与伴NS对照组相比差异无显著性意义（P > 0.05）,而伴Mor组小鼠CPP评分显著升高,提示褪黑素可能无诱导奖赏效应的作用。3.介导褪黑素抗吗啡奖赏效应作用的中枢褪黑素受体亚型分析3.1 i.c.v.给予褪黑素对小鼠吗啡诱导的条件性位置偏爱效应表达的影响小鼠侧脑室埋置注射套管后,同1.项方案建立CPP模型,于测定位置偏爱效应前10 min,各组小鼠分别侧脑室注射（i.c.v.）Mel以及Mel配药液,观察i.c.v.给予Mel对吗啡诱导的小鼠CPP效应表达的影响。结果显示,i.c.v. Mel（0.5,0.25mg/kg）可显著翻转吗啡诱导的CPP评分升高（P < 0.01,P < 0.05）,作用呈剂量依赖性,其有效剂量约为i.p. Mel（见2.2）的1%,提示褪黑素抗小鼠吗啡诱导CPP效应表达作用的主要作用部位可能位于中枢。3.2 i.c.v.给予褪黑素受体亚型阻断剂对褪黑素抗小鼠吗啡诱导的条件性位置偏爱效应表达的影响Luzindole为褪黑素MT1和MT2受体的非选择性拮抗剂,而K185为MT2受体亚型的选择性拮抗剂。在上述工作基础上,采取受体阻断手段,分析介导褪黑素抗吗啡诱导的CPP效应表达作用的中枢褪黑素受体亚型。小鼠42只,行侧脑室埋管手术后恢复5天以上,随机分为对照组（伴NS组）和模型组（伴Mor组）。同上方案建立CPP模型。模型组小鼠随机分为Mor对照组、Mel组和luzindole高、低剂量组四个亚组。Mel组及luzindole高、低剂量组小鼠分别i.c.v. 5μl luzindole配药液及luzindole 12.5μg、25μg,其余各组小鼠i.c.v.等体积luzindole配药液。10min后,Mel组及luzindole高、低剂量组小鼠均给予i.p. Mel 50 mg/kg,其余各组小鼠i.p.等体积Mel配药液。位置偏爱测定于i.p. Mel后15min进行。结果表明,Mor显著提高小鼠的CPP评分（P < 0.01）,表明在此条件下,CPP模型建立成功。Luzindole（12.5μg、25μg）可显著拮抗褪黑素对吗啡诱导的CPP评分升高的翻转作用（P < 0.01）,提示褪黑素抗吗啡诱导CPP效应表达的作用可能通过中枢褪黑素受体MT1和MT2亚型介导的。52只小鼠,行侧脑室埋管手术后恢复5天以上,同上方案建立CPP模型后,同上实验方案给予i.c.v K185 20μg、5μg。结果显示,K185（20μg、5μg）可显著拮抗褪黑素对吗啡诱导的CPP评分升高的翻转作用（P < 0.01）,提示褪黑素抗小鼠吗啡诱导CPP效应表达的作用可通过中枢MT2受体亚型介导的。26只小鼠,随机分为对照组（伴NS组）和模型组（伴Mor组）。同上建立CPP模型。于测定位置偏爱前10 min,模型组小鼠随机分为3组,分别i.c.v.配药液5μl,luzindole12.5μg和K185 25μg,对照组i.c.v. 5μl配药液。结果显示,luzindole或K185本身对小鼠吗啡诱导的CPP效应表达无显著影响（P > 0.05）。4.褪黑素抗吗啡奖赏效应作用的脑内分子机制4.1褪黑素抗大鼠吗啡CPP效应表达过程中伏隔核、海马内CREB样免疫阳性反应强度的变化实验大鼠随机分为对照组、模型组和Mel给药组。模型组和Mel给药组大鼠每天1次给予吗啡（5mg/kg, s.c.）,连续6天,制作吗啡依赖模型;第7天开始Mel组大鼠给予i.p. Mel 50 mg/kg,每天上午、下午各1次,共3次。第8天上午最后一次腹腔注射后6h处死大鼠制备脑片,进行免疫组化染色,计算机图像处理技术测定染色脑片核团内灰度值,观察到模型组大鼠海马和伏隔核内CREB样免疫阳性反应强度明显强于对照组,平均灰度值显著减少（P < 0.01）;Mel给药组大鼠伏隔核和海马内CREB样免疫阳性反应强度与模型组相比未见明显改变,平均灰度值无显著差异（P > 0.05）,提示吗啡奖赏效应表达过程中伏隔核、海马内CREB蛋白水平上调,而褪黑素对此无影响。4.2褪黑素抗大鼠吗啡CPP效应表达过程中伏隔核、海马内pCREB样免疫阳性反应强度的变化实验大鼠随机分为对照组、模型组和Mel给药组。同上方案进行免疫组化染色,计算机图像处理技术测定染色脑片核团内灰度值,观察到模型组大鼠伏隔核和海马内p-CREB样免疫阳性反应强度明显强于对照组,平均灰度值显著减少（P < 0.01）;Mel给药组大鼠伏隔核和海马内p-CREB样免疫阳性反应强度明显弱于模型组,平均灰度值显著增加（P < 0.01）,提示褪黑素可降低吗啡奖赏效应表达过程中伏隔核、海马p-CREB蛋白水平的上调。4.3褪黑素抗大鼠吗啡CPP效应表达过程中伏隔核、海马FosB蛋白水平的变化4.3.1褪黑素抗大鼠吗啡CPP效应表达过程中伏隔核、海马FosB样免疫阳性反应强度的变化实验大鼠随机分为对照组、模型组和Mel给药组。同上方案进行免疫组化染色和计算机图像处理,结果显示,各组大鼠伏隔核和海马内FosB样免疫阳性反应强度未见明显区别,平均灰度值无显著差异（P > 0.05）。4.3.2褪黑素抗大鼠吗啡CPP效应表达过程中伏隔核、海马△FosB蛋白水平的变化上述免疫组化实验所使用的FosB抗体识别的是全片段FosB和它的剪接异构体△FosB,因此△FosB的变化在免疫组化切片上有可能显示不出来。鉴此,采用Western Blotting法结合条带密度分析,观察褪黑素抗大鼠吗啡CPP效应表达过程中伏隔核、海马△FosB蛋白水平的变化。实验大鼠,随机分为对照组、模型组和Mel给药组,造模及给药方案同3.3.1项。于最后一次i.p.后6小时,断头取脑,分离海马和伏隔核。采用Western Blotting结合条带密度分析法,检测各组大鼠伏隔核和海马△FosB的含量。结果显示,各组大鼠伏隔核、海马内△FosB蛋白的条带未见明显区别,条带密度无显著性差异（P > 0.05）。结论1.褪黑素可抑制吗啡诱导的奖赏效应的表达,且自身无致奖赏效应的作用;褪黑素对吗啡诱导的奖赏效应的形成可能无影响。2.中枢神经系统可能是褪黑素发挥抗吗啡奖赏效应作用的主要作用部位;褪黑素可能通过激动脑内褪黑素受体MT1和MT2尤其MT2亚型而发挥抗吗啡奖赏效应作用。3.褪黑素抗吗啡奖赏效应作用可能与其抑制吗啡诱导的伏隔核、海马内磷酸化CREB蛋白水平上调有关。
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