基于竞争机制触发信号放大的核酸适体传感器研究

论文摘要

生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系中进行在线连续监测等优点,在化学、生物医学、环境监测、食品、医药和军事等领域有重要的应用价值。核酸适体由于具有与目标结合的高特异性和强亲和力,以及生物活性稳定,易于合成和保存等优点而成为一种极富应用潜力的识别探针,为生物传感器的研究提供了一个新的平台。本论文针对目前构建检测蛋白质传感器界面的焦点和难点问题,结合本实验室的优势,利用目标蛋白质引起两种竞争机制的改变触发信号放大,发展了几种用于蛋白质检测的特异性好且灵敏度高的核酸适体传感器构建方法。主要工作如下:在第二章中,我们利用适体探针、互补序列和挂锁探针三者之间的竞争反应提出了一种基于核酸适体特异性识别目标物导致滚环扩增放大反应,用以电化学检测PDGF-BB的可再生适体识别系统。当新设计的适体序列与目标蛋白质发生特异性结合时,促发了由一互补DNA序列、线形挂锁探针、和引物探针引发的滚环扩增反应。本适体识别系统巧妙地把多个功能元件整合为一个信号检测系统:独特的电化学检测技术、引人注目的滚环扩增放大反应、电极表面可逆的DNA杂交以及理想的适体-目标物的识别体系。基于滚环扩增的适体识别系统不仅展现了优越的分析性能,而且克服了传统适体传感器的局限性（例如:对信号目标物与适体特异性结合力的依赖,或对拥有两个或更多识别位点的目标序列夹心分析的要求）。回收实验证实了本实验方案的可行性。据此,本适体识别体系在蛋白质或其它分析物的研究中展现了良好的应用前景。第三章,我们在第二章的基础上将连接-滚环信号放大与分子信标降低背景相结合发展了一种应用于蛋白质均相检测的新方法。连接-滚环信号放大同样由竞争反应触发。有目标蛋白存在时,适体探针与目标蛋白特异性结合形成适体探针/分析物复合物,使得适体探针发生末端链置换。原先与适体探针相结合的互补序列被释放,从而与挂锁探针杂交。在DNA连接酶的作用下,挂锁探针被进一步环化并在Phi 29 DNA聚合酶的作用下通过滚环放大反应进行扩增。其产物包含成千上万个可以和分子信标检测探针互补杂交的重复序列。在不含目标蛋白时,适体探针与互补序列杂交形成适体探针/互补序列的二元复合物,这样互补序列就不能与挂锁探针杂交从而不能进行连接-滚环放大反应。以PDGF-BB为模型分析物,可以检测到1.36amol的蛋白质分子。而且,该方法只需根据目标蛋白和其适体序列的不同设计不同的互补序列和挂锁探针就可以实现对其他蛋白质的检测。在第四章中,我们提出一种新的纳米金团聚机理,即发夹型核酸适体粘性末端匹配修饰诱导纳米金组装,从而降低胶体稳定性,加入较高浓度的盐引起团聚。当溶液中存在目标分子IgE时,适体稳定的发夹构型显著抑制纳米金组装。鉴于此,我们开发了一种以IgE为分析模型的基于纳米金稳定性增强的均相比色分析方法。与目标IgE结合后,核酸适体构象发生变化,空间位阻增大,修饰到纳米金表面使颗粒稳定性增强,呈分散状态,据此可用于IgE的分析测定。与现有IgE检测方法相比较,该方法灵敏度高,所需仪器设备简便,可通过目视观察颜色变化或紫外可见分光光度计监测吸光度的变化。这种发夹型核酸适体衍生纳米金的组装行为在生物传感技术中的成功应用有助于加深理解核酸构象变换对纳米金性能的影响,同时也为设计新颖的信号探针以及开发性能优良的比色检测技术提供新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 生物传感器概述
• 1.2 核酸适体在生物传感器中的应用
• 1.2.1 核酸适体结合靶物质的构型变化
• 1.2.2 核酸适体电化学传感器的研究现状
• 1.3 金纳米颗粒聚集的光度技术
• 1.4 本研究论文的构想
• 第2章 一种基于适体识别目标物触发滚环放大检测蛋白质的电化学新方法
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 传感界面的构建及再生
• 2.2.3 适体识别触发连接滚环放大反应
• 2.2.4 目标物的检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 传感器设计原理
• 2.3.2 RCA 反应体系的优化
• 2.3.3 核酸适体探针序列和实验方案的选择
• 2.3.4 传感器的分析性能
• 2.4 小结
• 第3章 基于竞争触发滚环放大的蛋白质检测新方法
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 连接-滚环放大和蛋白质检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 实验原理
• 3.3.2 实验条件优化
• 3.3.3 检测体系的分析性能
• 3.4 小结
• 第4章 基于目标结合抑制适体粘性末端匹配诱导纳米金组装的光度法检测IGE
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与仪器
• 4.2.2 纳米金的衍生
• 4.2.3 IgE 检测与核酸适体对纳米金组装的影响
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 IgE 核酸适体结构分析
• 4.3.2 新的团聚机理提出与验证
• 4.3.3 IgE 适体对纳米金组装的影响
• 4.3.4 传感器的设计及可行性
• 4.3.5 IgE 比色传感器的分析性能
• 4.3.6 特异性与回收率
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢