灵芝子实体多糖（缀合物）的纯化、结构鉴定、分子改性和生物活性研究

论文摘要

灵芝（Ganoderma lucidum（Curtis:Fr.）P.Karst）在中国以及东南亚国家作为中草药应用于治疗各类疾病已有悠久的历史,其在临床上被应用于治疗肝炎、慢性支气管炎、哮喘、冠心病、心绞痛、高血压、高血脂、神经衰弱、肿瘤等多种疾病。然而,灵芝应用于疾病的治疗很大程度上依赖于古文献对其药理作用的记载,近年来,越来越多的研究者们对灵芝的作用机理和生物活性物质进行了研究。多糖（缀合物）作为灵芝中一种极为重要的生理活性物质,也同时受到了越来越多的关注；由于过去分析和技术手段的落后,对多糖类物质的研究主要集中对其单糖成分等进行简单的描述,很少深入地涉及对其结构较完整的阐述,所以给灵芝多糖药物及保健产品开发没有提供更深层次的资料,同时也没有为多糖一些生理活性机理的研究建立结构信息方面的基础。本文旨在通过对灵芝子实体多糖（缀合物）结构较深入地分析,同时结合化学改性和生理活性的研究,为进一步验证灵芝的药理活性以及促进灵芝相关产品或药品的开发、提升灵芝产品或药品的开发深度和广度提供更为深入的实验依据。1.灵芝子实体多糖（缀合物）分离纯化及理化性质研究119#灵芝子实体经醇脱脂,超滤分级,弱阴离子柱层析（DEAE-Sepharose Fast Flow）,部分组分经Sevag法脱去游离蛋白,凝胶柱层析（Sephacryl S系列、CL-6B等）和HPLC鉴定获得了二个均一多糖（LZ-C-1和LZ-D-1）和四个均一多糖肽LZ-B-1、LZ-C-2、LZ-C-3、LZ-D-4)和一个均一多糖—蛋白复合物LZ-D-7。用高效液相色谱法、苯酚—硫酸法和BCA法对其分子量、总糖含量和蛋白（肽）含量进行鉴定,结果如下：LZ-B-1、LZ-C-3、、LZ-D-4为白色粉末状样品,LZ-D-1、LZ-C-1、LZ-C-2为白色絮状样品,LZ-D-7为白色纤维状样品；LZ-B-1、LZ-C-1、LZ-C-2、LZ-C-3和LZ-D-1均易溶于水、二甲基亚砜；LZ-D-4、LZ-D-7可溶于水、二甲亚砜,且LZ-D-7的溶解度比LZ-D-4更小。2.灵芝多糖（缀合物）的结构研究2.1灵芝多糖（缀合物）多糖亚基的结构研究2.1.1灵芝多糖肽LZ-B-1多糖亚基的结构研究多糖肽LZ-B-1多糖亚基的一级重复结构单元主要由1,6-disubstituted-Galp,1,2,6-trisubstituted-Galp,1-substituted-Fucp,1,3-disubstituted-Glcp1,4,6-trisubstituted-Glcp,1-substituted-Glcp等单糖残基组成,其摩尔比大约为1：4：1：0.5：0.5：0.5,同时还有少量1,6-disubsituted-Glcp,1-substituted-Galp,1-substituted-Manp及1,3,6-trisubstituted-Manp等；其主要重复单元可能如下所示：2.1.2灵芝多糖LZ-C-1的结构研究多糖LZ-C-1一级结构主要由1-substituted-Fucp,1,2,6-trisubstituted-Galp,1-substituted-Glcp,1,6-disubstituted-Galp,1,3-disubstituted-Glcp和1,4,6-trisubstituted-Glcp等单糖残基组成,其摩尔比约为1：1：2：4：2：2,并且含有少量1,6-disubstituted-Manp和其它类型的单糖残基；其主要重复单元可能如下所示：2.1.3灵芝多糖LZ-D-1的结构研究多糖LZ-D-1一级结构主要由1-substituted-Fucp,1,2,6-trisubstituted-Galp,1,6-disubstituted-Galp和1,6-disubstituted-Glcp等单糖残基组成,其摩尔比约为0.96：1.00：4.01：0.64,并且含有少量1,6-disubstituted-Manp,1,3-disubstituted-Glcp和其它类型的单糖残基；其主要结构中可能存在以下重复单元：进一步通过分析可知残基1,6-disubstituted-Glcp可能与1,2,6-trisubstituted-Galp相连,同时可能每重复两次以上重复单元连接一个1,6-disubstituted-Glcp2.1.4灵芝多糖肽LZ-D-4多糖亚基的结构研究经过分析,多糖肽LZ-D-4的多糖亚基的主要结构可能为以下两种中的一种：2.2灵芝多糖（缀合物）糖亚基与蛋白（肽）亚基之间连接型式研究对LZ-B-1、LZ-D-4和LZ-D-7的多糖与蛋白质（肽）连接构型进行分析表明三种多糖—蛋白质（肽）复合物均可能为通过天冬氨基建立的N-连接构型。3.灵芝多糖肽LZ-D-4分子改性研究经过超滤、凝胶过滤所得的灵芝多糖肽均一体LZ-D-4,分子量为1.56×104Da,但其水溶性不是很理想；通过以氯磺酸-吡啶盐（CSA：Pyr=1：6）为酯化试剂制得了一种LZ-D-4的硫酸酯,命名为LZ-D-9。 LZ-D-9的得率为73%,分子量为1.30×104Da,硫含量为2.300%,取代度为0.12。LZ-D-4在DMSO中以吡啶、乙酸酐为酯化试剂制得了一种乙酰酯多糖LZ-D-10,其得率为900%,分子量为1.47×104Da,乙酰基含量为7%,取代度为0.85。提出了使用1HNMR积分面积推导乙酰基含量和取代度的方法,并建立了糖残基为六碳糖的计算方程：1)乙酰基含量的计算2)乙酰基的取代度的计算：取代度（D.S.）指的是乙酰基团在每个糖环的数量,计算公式如下：注：Aa为乙酰基的在1HNMB谱中积分面积；A1、A2…An为各种单糖残基在1HNMR中的积分面积4生物活性的研究经过分离纯化所得各组分进行了小鼠脾淋巴细胞（BALB/c）、小鼠淋巴癌细胞（L1210）和大鼠肾上腺嗜铬细胞来源的未成熟神经元细胞（PC12）活性研究。4.1灵芝子实体多糖（缀合物）及其衍生物的对小鼠脾淋巴细胞刺激作用研究发现超滤后组分GLPD对小鼠脾淋巴细胞的刺激作用明显优于总提取物GLP及另外两个组分GLPB和GLPC,并且呈现一定的剂量依赖性,当样品浓度为500μg/mL时,其刺激增殖率达到197%（10μg/mL阳性对照PHA刺激增殖率达到284%）,因此,超滤对获得刺激小鼠脾淋巴细胞作用提高的组分起到了一定的效果；经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析所得的各组分对刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖作用试验结果表明样品GLPBW、GLPBS2、 GLPDS1和GLPDS2对小鼠脾淋巴细胞的刺激作用明显高于其它供试样品,其样品的最高刺激率分别为273.05%、280.10%、282.34%和260.04%,均接近于阳性对照（PHA）,且前面三个样品具有浓度依赖性,其它样品对小鼠脾淋巴细胞刺激的增殖作用均明显小于阳性对照但具有一定的刺激作用,各样品对淋巴细胞的刺激作用存在着一定浓度依赖性；研究了组分GLPB、 GLPC、 GLPD及其经离子层析后所得各组分之间的活性比较,发现经离子层析后所得组分GLPBW、 GLPBS2、 GLPCS1、 GLPCS2、 GLPDS1、 GLPDS2对小鼠脾淋巴细胞的刺激作用明显地优于其上一级组分,从生物活性上分析达到了一定的分离效果；研究了经凝胶层析所得各均一多糖（缀合物）对小鼠脾淋巴细胞的刺激作用,发现样品LZ-D-7具有很强的刺激小鼠脾淋巴细胞的作用,当样品浓度为50μg/mL时其对小鼠脾淋巴细胞的刺激增殖率为283.58%,与阳性对照相当,当样品浓度为200μg/mL时其刺激率超过阳性对照,当样品浓度为500μg/mL达到333.15%,同时呈现了一定的浓度依赖性,样品LZ-B-1、LZ-D-1也表现出了一定的刺激作用,但效果不如LZ-D-7,其余样品对小鼠脾淋巴细胞有轻微的刺激作用；同时研究了LZ-D-4及其硫酸化和乙酰化衍生物对小鼠脾淋巴细胞的刺激作用,发现硫酸化样品LZ-D-9对小鼠脾淋巴细胞的刺激作用没有明显变化,但乙酰化样品LZ-D-10对小鼠脾淋巴细胞的刺激作用有所增加,说明了乙酰化从一定程度上能提高多糖的免疫活性。4.2灵芝子实体多糖（缀合物）及其衍生物的对L1210细胞毒毒性研究实验表明大部分组分对L1210均没有体外抑制作用,只有样品GLP、 GLPB、LZ-D-4及硫酸化样品LZ-D-9具有轻微的抑制肿瘤作用（细胞毒毒性）。4.3灵芝子实体多糖（缀合物）及其衍生物对PC12细胞的研究结果表明样品GLP、 GLPB、 GLPC、 GLPD、 GLPBS1、 GLPCS1、 GLPCS2、 GLPDS1对经H2O2损伤的PC12细胞的均具有一定的修复作用,并呈现一定的浓度依赖性,随着浓度升高,活性增强；乙酰化样品LZ-D-10具有对经H202损伤的PC12细胞的较强修复作用,当其浓度为500μg/mL时,其对PC12细胞的修复率达到145.46%,接近阳性对照NGF对PC12细胞的修复率156.89%,说明了乙酰化能提高多糖（缀合物）对经H202损伤的PC12细胞的修复作用；其余样品包括硫酸化样品对PC12细胞的修复作用均不明显。

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摘要

ABSTRACT

符号与名词缩写

第一章文献综述

第一节灵芝的研究概况

1 灵芝的生物学特性

1.1 灵芝的分类地位

1.2 灵芝的形态特征

1.3 灵芝的生活习性

1.3.1 分布

1.3.2 生活史

1.4 灵芝的生长习性及环境要求

1.4.1 营养

1.4.1.1 碳源

1.4.1.2 氮源

1.4.1.3 矿物元素

1.4.1.4 维生素

1.4.2 温度

1.4.3 水分和湿度

1.4.4 空气

1.4.5 光照

2 灵芝的化学成分

2.1 灵芝多糖

2.2 萜类和甾醇类化合物

2.3 其它化学成分

3 灵芝多糖生物活性的研究

3.1 免疫调节作用

3.2 抗肿瘤作用

3.3 抗辐射作用

3.4 抗血栓、血凝作用

3.5 降血糖作用

3.6 对神经系统作用

3.7 抗氧化和抗衰老作用

3.8 灵芝多糖的其它作用

第二节多糖的分离纯化和结构解析

1 多糖的纯化

1.1 多糖分离纯化的一般方法

1.1.1 分级沉淀或分级溶解

1.1.2 活性碳色谱法

1.1.3 离子交换色谱法

1.1.4 凝胶过滤法

1.1.5季按盐沉淀法

1.1.6透析法

1.1.7超滤法

1.2 多糖中蛋白质的去除

1.3 多糖中色素的去除

1.4 多糖中低聚糖、氨基酸等小分子物质的去除

2 多糖的含量和组成测定

2.1 多糖中糖含量的测定

2.2 多糖中单糖组成的分析

3 多糖的结构解析

3.1 化学分析的方法

3.1.1 高碘酸氧化法

3.1.2 Smith降解

3.1.3 甲基化反应

3.1.4 化学降解法

3.2 现代波谱学的方法

3.2.1 多糖UV-Vis图谱解析

3.2.2 红外光谱分析

3.2.3 质谱分析

3.2.4 核磁共振分析

3.2.4.1 一维核磁共振技术在多糖结构解析中的应用

1H NMR谱'>3.2.4.1.1¹H NMR谱

13C NMR谱'>3.2.4.1.2¹³C NMR谱

3.2.4.2 二维核磁共振技术在多糖结构解析中的应用

1H-¹H COSY'>3.2.4.2.1¹H-¹H COSY

3.2.4.2.2 TOCSY

3.2.4.2.3 NOESY和ROESY

3.2.4.2.4 HMQC（HSQC）和HMBC

3.2.4.3 NMR新技术在多糖结构解析中的应用

3.2.4.3.1 新脉冲序列和杂交技术在多糖结构解析中的应用

3.2.4.3.2 计算机辅助解谱程序在核磁共振解析多糖结构中的应用

3.2.4.4 展望

第三节本研究的目的意义和主要内容

1 研究目的意义

2 研究内容

第二章灵芝子实体多糖（缀合物）的分离纯化及理化性质分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 灵芝子实体来源

1.1.2 主要仪器

1.1.3 主要试剂

1.2 方法

1.2.1 灵芝子实体多糖（缀合物）的提取和粗分级

1.2.2 灵芝子实体提取物多糖含量的测定（张维杰,1999）

1.2.2.1 粗提物中还原糖含量的测定

1.2.2.2 粗提物中总糖含量的测定

1.2.2.3 多糖含量计算

1.2.3 粗提物的分离纯化

1.2.3.1 阴离子交换柱层析

1.2.3.2 凝胶柱层析

1.2.4 多糖的纯度鉴定和分子量测定

1.2.5 均一多糖（缀合物）的总糖含量测定

1.2.6 均一多糖（缀合物）蛋白含量测定

2 结果与分析

2.1 灵芝子实体多糖的分级分离

2.2 粗多糖的分离纯化

2.2.1 离子层析

2.2.2 凝胶层析

2.3 样品纯度鉴定和分子量测定

2.4 各均一多糖（缀合物）的总糖含量与蛋白（肽）含量分析

2.5 理化性质分析

3 小结与讨论

第三章灵芝子实体多糖（缀合物）的结构特征分析

第一节灵芝子实体多糖（缀合物）的组成分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 多糖（缀合物）单糖组成的定性分析

1.3 多糖（缀合物）单糖组成的定量分析

1.4 多糖（缀合物）的氨基酸组成分析

2 结果分析

2.1 多糖（缀合物）的单糖定性分析

2.2 多糖（缀合物）的单糖定量分析

2.3 多糖—蛋白（肽）复合物的蛋白（肽）亚基的氨基酸组成分析

第二节多糖（缀合物）的多糖亚基一级结构分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 傅立叶红外光谱（FT-IR）分析

1.2.2 甲基化分析

1.2.2.1 NaOH-DMSO试剂的制备

1.2.2.2 实验步骤

1.2.2.3 GC-MS色谱条件

1.2.3 部分酸水解

1.2.4 核磁共振分析

2 实验结果与分析

2.1 LZ-B-1多糖亚基的结构解析

2.1.1 LZ-B-1的红外光谱分析

2.1.2 LZ-B-1的糖残基的连接方式分析

2.1.3 LZ-B-1的核磁共振分析

2.2 LZ-C-1多糖结构解析

2.2.1 LZ-C-1的红外光谱分析

2.2.2 LZ-C-1的糖残基的连接方式分析

2.2.3 LZ-C-1的核磁共振分析

2.3 LZ-D-1多糖的结构解析

2.3.1 LZ-D-1的红外光谱分析

2.3.2 LZ-D-1的糖残基的连接方式分析

2.3.3 LZ-D-1的核磁共振分析

2.4 LZ-D-4多糖亚基的结构分析

2.4.1 LZ-D-4的红外光谱分析

2.4.2 LZ-D-4的糖残基的连接方式分析

2.4.3 LZ-D-4部分酸水解前后糖组成的比较研究

2.4.4 LZ-D-4部分酸水解前后甲基化分析比较

2.4.5 LZ-D-4的核磁共振分析

第三节灵芝多糖（缀合物）糖亚基与配体亚基连接形式初步研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 实验结果与分析

第四节本章小节

第四章灵芝多糖肽LZ-D-4的分子修饰和结构研究

第一节硫酸脂多糖肽的制备

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 试剂

1.3 仪器

1.4 方法

1.4.1 硫酸酯多糖肽LZ-D-9的制备

1.4.2 硫酸酯多糖肽LZ-D-9纯度及相对分子量测定

1.4.3 硫酸基含量的测定

1.4.4 取代度（D.S.）计算

1.4.5 红外光谱分析

1.4.6 核磁共振分析

2 结果与分析

2.1 硫酸脂多糖肽LZ-D-9的得率

2.2 硫酸脂多糖肽LZ-D-9纯度和分子量鉴定

2.3 硫酸脂多糖肽总糖和肽含量

2.4 硫酸基的含量和取代度

2.5 红外光谱分析

2.6 核磁共振分析

第二节乙酰酯多糖狀的制备

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 试剂

1.3 仪器

1.4 方法

1.4.1 乙酰酯多糖肽LZ-D-10的制备

1.4.2 乙酰酯多糖肽LZ-D-10纯度及相对分子量测定

1.4.3 红外光谱分析

1.4.4 核磁共振分析

1.4.5 乙酰基取代度和含量计算

2 实验结果与分析

2.1 乙酰酯多糖肽LZ-D-10的得率

2.2 乙酰酯糖肽LZ-D-10总糖和肽含量

2.3 乙酰酯多糖肽LZ-D-10纯度和分子量

2.4 乙酰基的取代度和含量

2.5 红外光谱分析

2.6 核磁共振分析

第三节本章小结

第五章多糖（缀合物）及其衍生物的生物活性研究

第一节多糖（缀合物）及其衍生物的体外免疫活性研究

1 试剂与材料

1.1 试剂

1.2 材料

1.2.1 供试样品来源

1.2.2 小鼠来源

2 方法

2.1 样品的配置

2.2 小鼠脾淋巴细胞的制备

2.3 小鼠脾淋巴细胞增殖率的测定

3 结果与分析

3.1 总提取物和超滤后所得各组分对小鼠脾淋巴细胞的刺激试验结果

3.2 阴离子柱层析后所得各组分对小鼠脾淋巴细胞的刺激试验结果

3.3 GLPB及该组分经离子柱层析所得各组分对小鼠脾淋巴细胞的刺激试验结果

3.4 GLPC及该组分经离子柱层析所得各组分对小鼠脾淋巴细胞的刺激试验结果

3.5 GLPD及该组分经离子柱层析所得各组分对小鼠脾淋巴细胞的刺激试验结果

3.6 所得几种均一体对小鼠脾淋巴细胞的刺激试验结果

3.7 GLPDS1进一步纯化后所得样品及衍生物对小鼠脾淋巴细胞的刺激试验结果

第二节多糖（缀合物）及其衍生物的抗肿瘤活性研究

1 试剂和材料

1.1 试剂

1.2 材料

1.2.1 供试样品来源

1.2.2 L1210细胞株

2 方法

2.1 样品的配置

2.2 L1210细胞的培养与活性试验

3 结果与分析

第三节多糖（缀合物）及其衍生物对PC12的活性研究

1 试剂和材料

1.1 试剂

1.2 材料

1.2.1 供试样品来源

1.2.2 细胞株

2 方法

2.1 样品制备

2.2 阳性对照NGF溶液的配置

2.3 PC12细胞的培养

2.4 培养基的配制

2O₂的配制'>2.5 H₂O₂的配制

2.6 氧化应激损伤修复试验（PC12试验）

3 结果与分析

第四节本章小节和讨论

第六章全文讨论与总结

第一节全文讨论

1 灵芝子实体多糖（缀合物）分离纯化及理化性质研究

2 灵芝多糖（缀合物）的结构研究

2.1 灵芝多糖（缀合物）多糖亚基的结构研究

2.1.1 灵芝多糖肽LZ-B-1多糖亚基的结构研究

2.1.2 灵芝多糖LZ-C-1的结构研究

2.1.3 灵芝多糖LZ-D-1的结构研究

2.1.4 灵芝多糖肽LZ-D-4多糖亚基的结构研究

2.2 灵芝多糖（缀合物）糖亚基与蛋白（肽）亚基连接型式研究

3 灵芝多糖肽LZ-D-4分子改性研究

4 生物活性的研究

4.1 灵芝子实体多糖（缀合物）及其衍生物的对小鼠脾淋巴细胞刺激作用研究

4.2 灵芝子实体多糖（缀合物）及其衍生物的对L1210细胞毒毒性研究

4.3 灵芝子实体多糖（缀合物）及其衍生物的对PC12研究

第三节本研究创新点

参考文献

附录

附录一实验仪器和试剂

附录二相关实验图片

致谢

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