论文摘要
脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase,LPL）是参与体内脂质代谢的主要成分之一,是催化血浆中甘油三酯（Triglyceride,TG）分解的关键酶。树鼩是不易感动脉粥样硬化动物。以往的研究表明树鼩总LPL活性远远高于人的总LPL活性,大约是人LPL活性的8倍;根据不同种属LPL氨基酸序列比较结果,以树鼩的序列为基准,对人的LPL进行定点突变得到多种人LPL突变体,经初步表达后发现Q402E突变体功能较野生型LPL明显升高。为进一步研究树鼩不易感动脉粥样硬化机理,本实验探索了脂蛋白脂肪酶Q402E突变体在毕赤酵母中的表达方法和条件,为进一步研究LPL突变体结构与功能关系提供有效的真核表达途径。[目的]构建Q402E突变体的毕赤酵母表达载体,将构建的表达质粒转染毕赤酵母X33菌株,通过调整诱导剂浓度、表达温度、表达时间和PH值,探索Q402E突变体在不同条件下的表达情况,为进一步研究LPL突变体结构与功能关系提供有效的真核表达途径。[方法]首先,通过转染DH5α而扩增本室冻存的ppcDNA3.1-Q402E质粒,并以扩增产物为模板、以带有XhoI、XbaI限制性酶切位点的核苷酸序列为引物,通过PCR法从ppcDNA3.1-Q402E质粒中获取带有上述酶切位点的Q402E序列。经XhoI、XbaI酶切消化毕赤酵母表达载体pPICZαA和所得Q402E以获得粘性末端,并通过琼脂糖凝胶电泳确定酶切效果。之后,在DNAligase作用下,将Q402E插入到pPICZαA中,构建Q402E酵母表达载体并对所构建质粒通过内侧引物法、外侧引物法和限制性内切酶分析法进行初步鉴定,并最终通过DNA序列测定明确Q402E成功插入到pPICZαA中并且没有发生异常突变。经确定后,将重组质粒转化通过CaCL2法制备TOP10F`感受态细胞、碱裂解法大量提取、聚乙二醇（PEG）沉淀法纯化。此后,将获得的重组质粒经限制性核酸内切酶SacI切割后,通过电转化方法将重组质粒转化并整合到酵母基因组,并先后通过含有100μg/ml Zeocin?的YPD平板进行Zeocin抗性筛选、MD、MM平板进行Mut+即甲醇利用型筛选。筛选后,提取筛选出的菌株基因组,并以其为模板、以含有部分LPL-Q402E核苷酸序列的寡核苷酸连为引物,通过PCR方法鉴定pPICZαA-Q402E是否成功整合到毕赤酵母基因组中。对成功整合的菌株进行复苏和扩增,并以甲醇为诱导剂进行初步表达。留取不同时间点菌液检测蛋白表达情况和表达时间段。经初步表达后,依次调整表达温度、诱导剂浓度,对比不同条件下表达情况。[结果]成功构建脂蛋白脂肪酶突变体Q402E的毕赤酵母表达载体pPICZαA-LPLQ402E,并证实其在毕赤酵母中可成功进行分泌式表达,且每毫升表达产物可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行观察。重组蛋白在诱导后24小时在相应分子量处有明显蛋白条带,之后条带逐渐加重,目的蛋白表达量增加,72小时后逐渐减轻,目的蛋白量减少;降低表达温度后,相同表达时间下目的蛋白表达无明显增加、但杂蛋白条带减少;增加或减少诱导剂浓度后,表达量无明显增加。[结论]1.成功构建脂蛋白脂肪酶突变体Q402E的毕赤酵母表达载体pPICZαA-LPLQ402.重组脂蛋白脂肪酶Q402E突变体在毕赤酵母X33菌株中可进行分泌性表达3.诱导后72小时重组蛋白表达量最高;降低表达温度可减少杂蛋白含量;增加或减少诱导剂含量对表达产物无明显影响。