糖原合成酶激酶3在油酸诱导胰岛β细胞凋亡中的作用及调控

论文摘要

第一部分抑制糖原合成酶激酶3活性对油酸诱导胰岛p细胞凋亡的作用[背景]近年来随着儿童肥胖症发病率明显升高,在世界范围内儿童肥胖已成为一种新的流行病,并导致与之相关的儿童2型糖尿病发病率增加。而儿童2型糖尿病的增多将严重影响全人类的健康状况,其并发症将会对个人、家庭和社会造成严重影响。2型糖尿病患者p细胞凋亡是其重要的发病机制,而糖原合成酶激酶3（GSK-3）被认为是一些凋亡信号途径的重要组成部分。[目的]本试验以油酸（OA）为凋亡诱导剂,观察GSK-3在大鼠胰岛INS-1细胞凋亡中活性的改变,探讨在此凋亡模型下GSK-3是否参与胰岛p细胞凋亡以及GSK-3抑制剂（氯化锂,LiCl）对β细胞凋亡的作用。[方法]应用细胞培养、流式细胞仪、免疫印迹法观察不同浓度OA处理下INS-1细胞（大鼠β细胞系）凋亡率的改变以及GSK-3磷酸化程度的变化,并用LiCl抑制GSK-3的活性后再检测INS-1细胞凋亡率的改变以及GSK-3磷酸化程度的变化。[结果]用不同浓度的OA（0-0.6mM）可诱导INS-1细胞发生凋亡,而随着OA浓度增加,INS-1细胞凋亡率亦增加。OA浓度为0.2mmol/L时,INS-1细胞开始出现明显的凋亡,OA浓度增加至0.4mmol/L时,INS-1细胞出现最大的凋亡百分数,但随着OA浓度进一步提高,INS-1细胞的凋亡不再随之明显增加。随后应用0.4mmol/LOA处理INS-1细胞,GSK-3磷酸化程度较正常组明显降低,但总GSK-3含量并无明显改变,提示GSK-3活性明显升高。而加入不同浓度的LiCl（0-36mM）时,随着LiCl浓度的增加,INS-1细胞的凋亡率逐渐减少,在用24mmol/L的LiCl对GSK-3的活性进行抑制后,INS-1细胞的凋亡率明显下降。[结论]0.4mmol/L的OA可通过激活GSK-3来诱导胰岛p细胞（INS-1）发生最大程度凋亡,而加入LiCI可通过抑制GSK-3活性在一定的程度上减少因OA诱导的INS-1细胞凋亡。说明GSK-3在OA诱导胰岛INS-1细胞的凋亡中发挥重要作用,而通过抑制GSK-3的活性对OA诱导的胰岛p细胞凋亡能够起到一定保护作用。本研究为2型糖尿病的治疗提供新的理论基础,并为其药物开发提供一个可能的靶点。第二部分PERK激活在油酸引起的糖原合成酶激酶3活化中的作用[目的]内质网应激是2型糖尿病胰岛β细胞发生凋亡的重要机制,PERK是一种重要的内质网跨膜蛋白,内质网过度活化可以持久的激活PERK从而引起细胞凋亡我们在前期的工作中已发现FFAs通过活化GSK-3导致胰岛β细胞凋亡,而长时间暴露于FFAs可引起胰岛β细胞发生内质网应激。本研究旨在探讨内质网应激和GSK-3在胰岛β细胞凋亡中的作用并探讨其可能的信号通路。[方法]采用Western Blot法分别检测内质网应激相关信号因子和激酶在OA处理前后的变化,明确内质网应激是否参与OA诱导的胰岛β细胞凋亡。同时用ELISA法检测PERK和AMPK两种激酶在OA处理后活性的改变。然后分别抑制PERK和AMPK的活性,再用Western Blot法检测GSK-3活性的变化,此时用Compound C来抑制AMPK的活性,而PERK活性的抑制是通过过表达P58IPK质粒来完成。最后采用免疫共沉淀和直接细胞荧光免疫法确定PERK和GSK-3是否存在共同作用。[结果]1.OA诱导胰岛INS-1细胞凋亡对内质网应激相关信号因子和激酶的影响加入0.4mM OA后,GRP78、ATF6、XBP1、PERK和AMPK的表达水平均增加,在统计学上均具有显著性差异（P<0.01）。2.ELISA法测定PERK和AMPK的活性加入OA后用ELISA试剂盒检测发现PERK和AMPK的活性均增加,且差异具有统计学意义（P（0.01）。3.分别抑制PERK和AMPK活性对GSK-3活性的影响：（1）OA处理后,GSK-3β活性较对照组增强,统计学上有显著性差异（P<0.01）；（2）在加入OA后单独抑制PERK活性,GSK-3活性较OA组降低,统计学上有显著性差异（P<0.01）；3）加入OA后单独给予AMPK抑制剂,GSK-3活性较OA组无明显变化,较空白组明显升高,统计学上有显著性差异(P（0.01）。由于PERK的抑制是通过过表达P58（IPK）质粒而实现的,因此用Flag的抗体进行检测,发现转染P58（IPK）质粒时,Flag显色增强,而其他均无显色,说明转染成功。4.PERK和GSK-3免疫共沉淀结果结果提示PERK和GSK-3存在直接作用。5.PERK和GSK-3在OA诱导胰岛INS-1细胞中共定位结果用FITC标记PERK（显色为绿色）,罗丹明标记GSK-3β（显色为红色）,重叠后发现PERK和GSK-3β有明显共定位。[讨论]长时间暴露于游离脂肪酸可通过内质网应激途径活化GSK-3诱导胰岛β细胞发生凋亡,而内质网应激的标志物PERK在这一过程中可以通过直接和GSK-3作用并活化GSK-3活性,故PERK-GSK-3信号通路可能在2型糖尿病发病的关键环节β细胞凋亡中起到重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 序言
• 第一部分 抑制糖原合成酶激酶3活性油酸诱导大鼠胰岛β细胞凋亡的保护作用
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 PERK激活在油酸引起的糖原合成酶激酶3活化中的作用
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 英文缩写词及中文对照
• 致谢