鸡腿菇漆酶诱导、对染料脱色及基因克隆研究

论文摘要

漆酶是一类含铜的多酚氧化酶,能催化木质素的降解,去除有毒化合物的毒性,脱除工业染料的颜色,在环境保护、制浆造纸、纺织印染等领域具有广泛的应用前景。鸡腿菇产漆酶采用静止和摇床培养两种方式,发现静止培养第21天酶活为0.55IU/ml,摇床培养第7天便可以达到相同的酶活,第19天酶活最高,可达1.61 IU/ml,摇床培养缩短鸡腿菇产酶周期且漆酶最高酶活是静止培养的三倍,说明摇床培养比静止培养更有利于鸡腿菇产漆酶。培养基碳氮比是鸡腿菇产漆酶的又一重要影响因素,在本实验中设计了HNHC、HNLC、LNHC、LNLC四种培养基对鸡腿菇进行诱导产酶比较,结果显不LNHC培养鸡腿菇产漆酶酶活最高,HNLC培养可产生更多的漆酶同工酶。基于以上结果,选择LNHC、HNLC两种培养基添加不同浓度诱导物诱导鸡腿菇产漆酶,LNHC培养条件下邻甲苯胺诱导鸡腿菇产漆酶酶活最高,可达3.25IU/ml。HNLC培养条件下2mM邻甲苯胺和0.8mM单宁酸都稳定的诱导提高鸡腿菇不同的漆酶同工酶的含量。分别收集LNHC、HNLC两种培养基中添加不同诱导物后鸡腿菇分泌的漆酶粗酶液对染料进行脱色,2ml 0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液的脱色体系中,染料终浓度50mg/ml,酶添加量0.5IU/ml, HBT的终浓度0.1g/L,pH4.5,温度40℃,时间12h。实验证明,添加不同诱导物的两种培养基中得到的鸡腿菇漆酶粗酶液对蒽醌类染料及三苯甲烷类染料比对偶氮类染料具有较好的脱色效果,邻甲苯胺诱导的漆酶粗酶液对葸醌类雷玛唑亮蓝和三苯甲烷类溴酚蓝的脱色率分别为71%、78%,对偶氮类的活性橙1、刚果红的脱色率分别为14%、4%。另外,HNLC培养基中添加邻甲苯胺和对羟基苯甲酸诱导的含多种漆酶同工酶的粗酶液比LNHC培养的单一组分漆酶对部分葸醌类染料的脱色效果好,而HNLC阿魏酸和铜离子诱导的多组分的漆酶比LNHC单一组分的漆酶粗酶液对染料的脱色效果好。介体HBT的加入对所有染料的脱色率都有显著的提高。根据实验室之前克隆的漆酶的基因片段设计特异性引物,使用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit得到完整的鸡腿菇漆酶cDNA基因,命名为lac3。鸡腿菇漆酶lac3OcDNA全长1968bp,编码区为1554bp,编码了535个氨基酸,5’非编码区为279bp,3’非编码区为145bp；前18个氨基酸为信号肽；理论等电点为5.29,理论分子量为50064.87Dalton。使用EasySlectTM Phichia Expression Kit对克隆得到的漆酶lac3进行异源表达,载体为pPPICZaB,宿主菌为KM71H （Muts, Arg+）。平板培养和摇床诱导产酶培养均未检测到漆酶Lac3的活性。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 漆酶的结构与性质
• 1.2 漆酶的催化机理
• 1.3 漆酶的研究进展
• 1.3.1 漆酶的诱导
• 1.3.2 漆酶的分离纯化
• 1.3.3 漆酶的分子生物学
• 1.4 漆酶的应用
• 1.4.1 食品工业
• 1.4.2 染料的脱色
• 1.4.3 造纸工业
• 1.4.4 有毒化合物的生物消除
• 1.4.5 其他方面
• 1.5 本论文研究的目的、意义及内容
• 1.5.1 研究的目的及意义
• 1.5.2 研究的内容
• 2. 鸡腿菇漆酶的产酶诱导
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 药品
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 鸡腿菇的培养方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 静止和摇床培养对鸡腿菇产漆酶的影响
• 2.3.2 不同碳氮源比例的四种培养基对鸡腿菇产漆酶的影响
• 2.3.3 LNHC培养基添加不同诱导物对鸡腿菇产漆酶的影响
• 2.3.4 HNLC培养基添加不同诱导物对鸡腿菇产漆酶的影响
• 2.4 本章小结
• 3. 鸡腿菇漆酶对不同染料的脱色
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 药品
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 鸡腿菇的培养及粗酶液的制备
• 3.1.5 漆酶活力的测定
• 3.1.6 过氧化物酶活力的测定
• 3.1.7 非变性胶（Native-PAGE）电泳分析方法
• 3.1.8 染料脱色方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 两种不同培养基培养鸡腿菇粗酶液对染料脱色的影响
• 3.2.2 邻甲苯胺诱导鸡腿菇的粗酶液对染料脱色的影响
• 3.2.3 铜离子诱导鸡腿菇的粗酶液对染料脱色的影响
• 3.2.4 阿魏酸诱导鸡腿菇的粗酶液对染料脱色的影响
• 3.2.5 对羟基苯甲酸诱导鸡腿菇的粗酶液对染料脱色的影响
• 3.3 本章小结
• 4. 鸡腿菇漆酶基因的克隆及表达
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 试剂盒
• 4.1.3 酶及试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 漆酶Lac3 cDNA全长的获得
• 4.2.2 表达载体的构建
• 4.2.3 表达载体电转化入Pichia pastoris
• 4.2.4 具有漆酶Lac3活性的阳性克隆的筛选
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 漆酶Lac3 cDNA全长的获得
• 4.3.2 鸡腿菇漆酶基因Lac3 cDNA序列分析
• 4.3.3 表达载体的构建
• 4.3.4 表达载体电转化入Pichia pastoris
• 4.3.5 具有漆酶Lac3活性的阳性克隆的筛选
• 4.4 本章小结
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 详细摘要
• Abstract