TFPI-2基因启动子区异常甲基化与胰腺癌关系的研究

论文摘要

胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，尽管最近的病理诊断、分子生物治疗上有所发展，但总的阶段生存率仍只有4%。尽管在一级预防、手术治疗，放、化疗联合治疗上做出了巨大努力，这些病人长时间的生存率未能得到本质上的提高[1-2]。和其他恶性肿瘤一样，胰腺癌的发生发展涉及到环境和遗传等因素。在遗传因素中，胰腺癌的发生发展过程与癌基因和抑癌基因密切相关，癌基因和抑癌基因功能的改变在胰腺癌的发生发展中起着关键作用。抑癌基因在控制细胞生长，增殖及分化过程中起着十分重要的抑制作用，能潜在抑制肿瘤生长。如果抑癌基因的功能失活或出现基因缺失、突变等异常，就可能导致细胞发生恶性转化进而导致肿瘤的发生。抑癌基因失活的原因可有基因缺失、点突变、低表达和高甲基化等。其中抑癌基因的甲基化改变而导致该基因失活机制的研究逐渐受到重视。人TFPI-2最早是由Jandial和Horne发现于胎盘而命名为胎盘蛋白-5。后人对TFPI-2基因的研究逐步深入，发现其不但具有广泛的抑制蛋白酶的作用，还具有抑制肿瘤发生发展的作用。在已有的研究中，TFPI-2基因被认为在肝癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌、神经胶质瘤、纤维肉瘤等多种恶性肿瘤中具有抑制肿瘤发生发展的作用，TFPI-2基因的缺失往往促进了肿瘤的浸润和转移[3-6]。在另一方面，一些研究显示，在肿瘤组织中TFPI-2基因缺失的原因可能与TFPI-2基因启动子区高甲基化有关[7]。据此，本研究以手术切除的胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织、胰腺癌Panc-1细胞株作为实验对象，应用细胞培养，逆转录-多聚合酶链反应（RT-PCR），Western-blot和甲基化特异性PCR（MSP）等方法,研究胰腺癌及正常组织中TFPI-2基因甲基化状态、胰腺癌Panc-1细胞在去甲基化药物5-Aza-dC处理前后TFPI-2基因的mRNA及蛋白表达的变化。该实验可见，TFPI-2基因表达的缺失与胰腺癌发生发展的紧密相关性。我们进一步研究了TFPI-2基因表达的改变及其启动子区甲基化状态的改变，以及TFPI-2基因甲基化状态改变前后表达情况改变的机制，为胰腺癌患者早期特异性诊断和预后判断及去甲基化药物干预治疗提供客观的观察指标，并为开展胰腺癌的基因和分子治疗提供实验依据。第一部分胰腺癌组织与正常组织中TFPI-2基因启动子区甲基化状态的研究目的：检测胰腺癌组织TFPI-2（组织因子途径抑制物-2）基因CpG岛甲基化的状态，并分析甲基化改变与胰腺癌的关系。方法：应用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测45例胰腺癌组织、相应癌旁组织、8例正常胰腺组织中TFPI-2基因的甲基化状态。结果：胰腺癌组织中TFPI-2基因的甲基化阳性率为71.1%（32/45），明显高于癌旁组织的31.1%（14/45）（P<0.01）。8例正常胰腺组织中均未发生甲基化。TFPI-2基因甲基化阳性率还与胰腺癌的临床分期、组织分化程度、肿瘤直径具有相关性（P<0.05）。结论：TFPI-2基因在胰腺癌组织中出现异常甲基化，可能与胰腺癌的发生发展关系密切。第二部分去甲基化药物5-Aza-dC处理前后胰腺癌Panc-1细胞TFPI-2基因启动子区甲基化状态及表达的研究目的：探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胰腺癌细胞系Panc-1中抑癌基因组织因子途径抑制物-2（TFPI-2）甲基化水平及基因表达的影响。方法：用不同浓度5-Aza-dC处理胰腺癌细胞系Panc-1。用甲基化特异性PCR（MS-PCR），逆转录聚合酶链（RT-PCR）及蛋白印迹实验（Western blot）检测药物处理前后Panc-1细胞TFPI-2基因的甲基化状态，mRNA及蛋白表达的改变。结果： MSP检测Panc-1细胞TFPI-2基因药物作用后异常甲基化得到逆转，RT-PCR检测到不同浓度5-Aza-dC处理后TFPI-2基因mRNA重新表达，相对表达量分别为0.211±0.087,0.327±0.068,0.609±0.017，Western Blot检测TFPI-2基因蛋白重新表达，相对表达量分别为0.429±0.121，0.675±0.044，1.132±0.124，以上作用呈时间、剂量依赖性（P<0.05），具有统计学意义。结论：胰腺癌细胞系Panc-1中抑癌基因TFPI-2启动子高甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5-Aza-dC能够较成功的逆转胰腺癌细胞Panc-1中TFPI-2基因的高甲基化状态，并能恢复TFPI-2基因的mRNA及蛋白重新表达。

论文目录

• 英文缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 胰腺癌组织与正常组织中 TFPI-2 基因启动子区甲基化状态的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 5-AZA-dC对人胰腺癌Panc-1细胞TFPI-2基因mRNA及蛋白表达的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献