论文摘要
帕金森病是一种以静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高和姿势平衡障碍为主要临床特征,选择性中脑黑质多巴胺能神经元丧失、纹状体多巴胺含量显著减少,以及黑质及篮斑出现路易小体（Lewy body）为其病理特点的老年神经退行性疾病。综合世界各国资料,帕金森病的发病率稳定在10-405/10万人口左右,以前我国报道的发病率为44/10万,属于该病的低发地区,但是,最近的调查发现我国帕金森病的发病率与西方发达国家相似,发病率较高。黑质多巴胺能神经元变性、丢失,从而导致的纹状体递质系统功能紊乱和皮质-基底节-丘脑-皮质环路的异常活动是引起帕金森病主要症状的直接原因。该病最早是在1817年由英国医生Jame Parkinson首先描述。至今病因不明。目前治疗主要分为两大类:内科药物治疗主要针对递质代谢紊乱的纠正,外科治疗着重于改变神经环路的异常活动。目前治疗均为对症治疗,不能根本改变疾病的进展,这些治疗存在着治疗效果差、副作用多的缺点。近些年来,随着对帕金森病基础研究的进一步深入以及多种帕金森病动物模型的建立,PD的治疗策略发生重大转变,逐渐由对症治疗转向能从根本上延缓病程的神经保护和修复治疗。各种神经营养因子,特别是GDNF一直是研究的热点。本研究围绕帕金森病和GDNF的治疗作用进行了两个方面的研究:（1）使用phMRI监测GDNF治疗帕金森病效果的动物实验研究;（2）MPTP建立早期PD动物模型的研究。（1）目前,神经胶质细胞源性的神经营养因子（GDNF）是在帕金森病治疗研究中最受关注的神经营养因子,GDNF在动物实验中显示了对帕金森病良好的治疗作用,GDNF不仅具有很强的多巴胺能神经元营养效应,而且在黑质-纹状体多巴胺能系统的神经保护和损伤修复方面具有良好的作用。营养因子GDNF的治疗作用也在治疗帕金森病的临床Ⅰ期试验中得到初步证明。有充足的证据证明GDNF能保护并促进纹状体的SNc和轴突中前突触多巴胺能神经元的生存。GDNF对中脑多巴胺能神经元有强大的保护和修复作用,所以有望成为治疗帕金森病的主导药物。临床预试验及临床研究均证明GDNF等神经营养因子只有通过靶向给药才能发挥其疗效。在进一步研究GDNF对帕金森病的治疗作用以及将GDNF治疗推向临床的过程中,仍有许多问题有待解决,比如治疗时机、给药途径、剂量以及检测方法。我们通过药理学MRI测量多巴胺激动剂阿扑吗啡（apomorphine,APO）引起的血氧氨基血红蛋白水平依赖（BOLD）反应,监测GDNF治疗单侧帕金森病猴动物模型前后,其基底节中功能学改变的情况。首先,在正常状态下测量了BOLD对APO的反应后,然后用相同浓度的APO刺激经过诱导的帕金森症模型,进行扫描,接着将所有的动物缓慢地用GDNF治疗18个周,治疗是通过植入导管并和体外一个可编程的泵系统进行连接,导管是利用外科手术植入右壳核并通过柔软的聚氨酯管连接至泵,通过该系统每日向试验动物壳核注入22.5ug GDNF,最后在第6和18周分别进行phMRI扫描。同时,对试验动物行为改变的监测贯穿于整个研究过程。这些研究初步发现,与慢性GDNF治疗前的数据相比,在试验动物的壳核中,APO引发的激活作用被持续性壳核内注入的GDNF减弱了,并伴随着帕金森病症状,行动速度和APO诱导的旋转的明显改善。这些结果表明,phMRI联合选择性DA激动剂可以对GDNF等神经营养因子治疗帕金森病的作用进行连续的无创监测。方法首先,我们采用MRI引导下立体定向技术在实验动物右侧壳核置管,导管外端连接SnchroMed程序化泵,这是一个可编程的泵,可以调节GDNF注入的剂量、速度以及时间,通过该系统治疗帕金森病动物模型已被证实有效。然后,通过药理学MRI测量阿扑吗啡（apomorphine,APO）引起的血氧氨基血红蛋白水平依赖反应（BOLD）,来检测GDNF对MPTP诱导的单侧帕金森病猴模型的治疗作用,这是一种可以用来连续性监测帕金森病治疗效果的成像方法,具有无侵袭性、高敏感性、和可广泛利用性。结果所有动物在经过MPTP注射后的第8周都表现出稳定的、单侧的帕金森病特征,包括慢性晕动症、左上肢和左下肢强直、弯腰姿势及平衡能力差。经过0.1mg/kg的阿扑吗啡治疗后（见图3）,这些帕金森病特征除了姿势外均有显著的改变。另外,所有的动物都观察到了阿扑吗啡诱导的逆-顺时针方向的旋转行为（转向MPTP损伤侧）。所有将导管植入壳核的动物在导管植入时均没有发生并发症,同样,在手术后或持续性GDNF治疗过程中也没有出现副反应。在输注GDNF治疗6周后,运动功能出现明显改善,平均提高22%（见图4A）,并且维持到18周。运动功能的改善还表现在运动速度的明显增加（见图4B）。这些改变大致与帕金森病症状等级相平行。此外,到第6周,GDNF治疗使阿扑吗啡诱导的交替运动显著减少了87%（见图4c）,在GDNF治疗后的第18周同样可以看到显著的减少。在MPTP处理之前,壳核和尾状核未发现阿扑吗啡诱导的活化有明显变化（见图5A）,在MPTP处理之后,就可以发现MPTP作用同侧的相同区域有强的阿扑吗啡诱导活化现象（见图5B、7A）。正如预测的那样,慢性壳核内GDNF灌注不仅明显改善运动功能,并且和GDNF治疗前搜集的数据相比,经过6-18周的治疗明显降低了同侧壳核内阿扑吗啡诱导的活化,治疗后6-18周BOLD活化也明显降低,降至接近去多巴胺神经支配的基线水平（见图6A）。然而,GDNF治疗对尾状核功能的改变好像是双相的（治疗6周后阿扑吗啡诱导活化水平轻度增高,而治疗18周后阿扑吗啡诱导活化水平明显降低）（见图6B）。数据并没有显示在SN有BOLD信号的改变。GDNF治疗后典型的BOLD信号改变见图7。将BOLD效应附加于同一天相同的实验动物的T1加权相上,可以看到阿扑吗啡诱导的活化幅度与GDNF治疗以前相比出现明显的降低。尸体解剖可以显示导管周围的弥散半径。大部分治疗后的壳核中可以发现GDNF染色阳性（见图8）。沿导管均可见GDNF播散,其末端弥散半径至少3mm。结论:我们希望通过本次研究验证phMRI技术与选择性多巴胺能激动剂联合应用可以监测GDNF在治疗帕金森病方面的作用。具体的说,这项研究为了确定在患有帕金森病的恒河猴中,在MPTP损伤的壳核中APO诱导的活化的振幅能够被持续的GDNF治疗减弱。（2）近些年来,PD的治疗策略正在由副作用和并发症都非常严重的对症治疗逐渐向能从根本上延缓病程的神经保护和修复方向发展。在新的神经保护和恢复治疗研究中,作为帕金森氏病治疗的最佳阶段,如何进行早期治疗以及使用影像学检查（如phMRI扫描）进行早期治疗效果的评价被认为是一个非常重要的议题。探索各种治疗方法的有效性就需要建立一个适当的早期帕金森病的动物模型。这个早期帕金森病动物模型需要能够满足以下要求:1、该动物模型可以模拟人类早期帕金森病的病理、生化改变,2、该动物模型可以出现与人类帕金森病相似的临床症状,而且能够稳定的表达,不会自行恢复,3可以模拟帕金森病人对治疗的反应。因此,在本实验研究中,我们希望能够通过控制MPTP（对甲基-苯基-四氢吡啶）的剂量、给药途径（颈内动脉注射）以及实验动物的年龄等因素,建立一个稳定的非人类灵长类动物的早期帕金森病动物模型。我们希望使用这个早期帕金森病动物模型再次进行关于phMRI的研究,以探索phMRI在早期帕金森病监测方面的作用。方法在本次试验中,我们选用27只中年恒河猴（16-19岁）,通过单侧颈内动脉注入小剂量（0.12毫克/公斤体重）MPTP的方法,建立非人类灵长类动物单侧帕金森病动物模型。所有实验动物均经过12个月的行为习性观察,证实具有稳定的帕金森病特征。然后,通过尸检以及病理、生化研究,与晚期帕金森病动物模型相比较,证明有更多的多巴胺能神经元残留在黑质系统中,同时有更多的多巴胺能神经纤维存在于纹状体中。结果经MPTP处理后,单侧帕金森特点在两周后出现,六到八周达到稳定。运动性功能障碍在整个过程自始至终出现,没有实验动物出现动作恢复或进行性机能衰减（图1A）。没有实验动物需要增加MPTP的剂量了来维持它们帕金森病症状水平。帕金森病特征表现包括运动徐缓、MPTP输入对侧上下肢体僵直（图1B）。另外,弯腰体位与轻微姿势不稳定在所有动物中被证实。严重损伤的恒河猴表现出运动震颤,这一特点在试验组的动物中没有或很少表现。与晚期PD组PD得分8.3+/-0.15相比,早期PD组得分为5.3+/-0.15。另外,在MPTP五个月后注入左旋多巴,其帕金森病特征表现经过左旋多巴治疗出现明显的改善（图1B）。PD分数与稳定模型12个月的视频跟踪系统收集的结果相一致（图2A&B）。在MPTP试验结束一个月后,运动距离和速度都减少约0～44%。和其它的PD特点一样,在进行左旋多巴激发,其运动距离与速度都明显增加（图2A&B）。在PD早期组的TH+多巴胺神经元无偏倚立体细胞计数显示损失了68%的神经元（图3）。而作为对比的PD晚期组的细胞数下降87%。在两组动物中神经细胞损失在黑质腹外侧非常明显（图4 A&B）,但TH+细胞损失在晚期组动物中更加明显（图4B）。在黑质和壳核的中外侧出现TH+染色损失（图5A&B）。如看到的图6,在早期PD组黑质和壳核损伤侧TH+纤维密度经密度测定明显降低,经TH+纤维染色大约各自是正常对比区的30%和50%。相对比,经高浓度的MPTP诱导的晚期PD猴产生更严重的损失,相比对侧TH+的残留密度大约只有1%（图6A & B）。通过10只动物分析了多巴胺释放的动力学改变。由于没有修正的数值能更好的与真实值相关,所以没有修正体外恢复的数值。注射MPTP6个月后收集双侧黑质和壳核的数据。给动物注射微小剂量的神经毒素后,通过钾和苯丙胺诱发的多巴胺流量出现明显地降低,分别从63.4%到98.9%不等（见表2）。在脑组织中,与对照组相比,尾状核中的多巴胺水平也相应的降低了97.45%,壳核降低了97.9%。多巴胺的原始代谢产物,高香草酸和3,4—二羟苯乙酸也分别降低了82.3%至96.4%不等（见表1）。注射小剂量MPTP后的磁共振检查（表3,图8）以及尸体解剖组织切片检查（图9）均显示,注射小剂量MPTP对苍白球所产生的损害相对较小。与黑质多巴胺系统的其它影响相一致的是,运用两种MPTP剂量,多巴胺及其代谢产物均有明显的下降。表1中的正常值作为对照,在早期阶段的模型,与没有损失的一侧相比,尾状核和壳核中多巴胺水平下降98%,然而DOPAC和HVA分别下降95%和83%（见表1）。在晚期PD动物模型中,DA,DOPAC和HVA在壳核中减少了99%（见表1）。HVA水平在早期模型中明显高于晚期模型,这与轻度损伤是一致的（P＜0.05,表1）。在早期和晚期模型中,壳核的HVA/DA比值也明显的较正常壳核值大。另外,DOPAC/DA的比值在早期模型中明显高于正常壳核,在晚期模型中,比值虽然也比较高,但是无明显统计学差异。在早期阶段的动物中,尾状核和壳核中DA与DOPAC水平没有显著的不同（图7A）。然而HVA水平在壳核中明显高于尾状核（图7A）。在晚期PD动物中,壳核和尾状核也没有明显的不同。虽然多巴胺和DOPAC水平在壳核中低于尾状核中的水平,但由于尾状核变异较大使其没有达到很明显的统计学差异（图7B）。结论:通过以上研究证明:我们可以通过单侧颈内动脉注入小剂量（0.12毫克/公斤体重）MPTP的方法,在中年恒河猴中建立一个温和且稳定的早期帕金森病动物模型。