人骨髓间充质干细胞增殖、分泌、凋亡、迁移和黏附影响因素及机制

论文摘要

骨髓干细胞是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞，利用其可分化为多种细胞的能力，可作为受损心肌组织修复的供体细胞。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓中除造血干细胞以外的另一类多能干细胞，可能成为一种理想的修复损伤心肌的移植用细胞，其治疗缺血性心脏病、扩张性心肌病等原因引起的心功能不全的研究尚处于起步阶段，正日益受到关注。本研究以人MSCs为研究对象，探讨其增殖、旁分泌、迁移、凋亡过程中不同药物的影响，及相关的细胞信号传导途径。第一部分人骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及诱导分化[目的]分离并培养人MSCs，纯化扩增，为进一步进行药物干预研究打基础，并检测细胞表型。使用5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）将人MSCs向心肌细胞方向诱导分化，进行细胞鉴定，以满足实验的需要。[方法]抽取志愿者骨髓液，使用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，并借助MSCs黏附于塑料瓶底这一特性进行纯化。相差显微镜观察形态变化，流式细胞仪检测CD34、CD105、CD106表面抗原表达，鉴定MSCs。将MSCs传代扩增培养，取第6代MSCs经5-aza诱导分化，相差显微镜观察形态变化，免疫化学鉴定细胞诱导前后肌球蛋白重链β和心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）表达。[结果]将密度梯度离心法与贴壁法相结合，可获得较多的MSCs，通过传代后细胞进一步纯化，每个25cm2细胞培养瓶接种2×105个细胞，完全培养液胎牛血清浓度为10％，80％～90％细胞融合后按1：3或1：2比例传代，MSCs能稳定地传代扩增而无明显分化迹象。原代细胞培养2周左右可首次传代，以后7d左右传代一次，传到第6代未发现属性改变，呈现成纤维细胞样生长。应用5-aza对第6代细胞进行诱导分化2周，发现细胞形态变大，连接紧密，呈条索状，外表似心肌细胞，诱导前MSCs肌球蛋白重链β和cTnT表达均阴性，诱导后则均为阳性表达，阳性细胞率约为21％。[结论]应用密度梯度离心法密度梯度离心法与贴壁法相结合，可建立人MSCs体外稳定的纯化扩增方法。体外5-aza诱导后2周，MSCs从形态和蛋白表达水平上向心肌细胞方向分化，符合实验要求。第二部分促红细胞生成素、普伐他汀、红景天苷、抗血小板药物对人骨髓间充质干细胞增殖、旁分泌和分化的干预研究[目的]观察重组人促红细胞生成素（recombinant human EPO，rhEPO）、普伐他汀、红景天苷、抗血小板药物干预对人MSCs增殖、血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）分泌、分化的影响。[方法]体外扩增培养人MSCs，绘制生长曲线，使用上述药物干预第6代人MSCs，相差显微镜观察药物作用后细胞形态学变化，四甲基偶氮唑盐[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]比色法检测细胞增殖情况，酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法测定细胞VEGF分泌，流式细胞仪检测细胞抗原CD34、CD105、CD106表达变化，免疫化学观察药物预处理后经5-aza诱导，人MSCs cTnT抗体染色阳性细胞率的变化。[结果]（1）细胞增殖情况：传代细胞潜伏期为48h左右，对数增殖期约为接种后第4～6d，至接种后第7d进入平台期。经药物作用后的人MSCs形态和细胞表面抗原CD34、CD105、CD106表达无明显变化。反映MSCs增殖变化的OD570值在一定浓度rhEPO（0．01U／mL～10U／mL）、普伐他汀（0．2μmol／L～10μmol／L）、红景天苷（0．2mg／L～2mg／L）、氯吡格雷（0．02μmol／L～40μmol／L）和噻氯匹定（0．02μmol／L～40μmol／L）作用后明显高于对照组（P＜0．05），而部分浓度的阿司匹林组（60μmol／L～2000μmol／L）则显著低于对照组（P＜0．05）。（2）细胞VEGF分泌：人MSCs分泌的VEGF水平在高浓度红景天苷（5mg／L）、高浓度氯吡格雷（40μmol／L）和噻氯匹定（40μmol／L）作用后明显低于对照组（P＜0．01），而低浓度普伐他汀（0．2μmol／L）、阿司匹林组和低浓度氯吡格雷组（0．02μmol／L）VEGF水平与对照组无明显差异，rhEPO、高浓度普伐他汀（100μmol／L）、低浓度红景天苷（0．2mg／L）和低浓度噻氯匹定（0．02μmol／L）VEGF水平则显著高于对照组。（3）细胞分化情况：细胞表面抗原CD34、CD105、CD106在6种药物作用后与对照组相比无明显差异。促红细胞生成素、普伐他汀、红景天苷、氯吡格雷、噻氯匹定和阿司匹林预处理后经5-aza诱导，人MSCs cTnT单克隆抗体染色阳性细胞百分率无明显变化（P值分别为0．597、0．952、0．325、0．141、0．830和0．072）。[结论]rhEPO、普伐他汀、红景天苷、氯吡格雷和噻氯匹定对人MSCs有明显的促进增殖作用，而阿司匹林则抑制其增殖。高浓度红景天苷、氯吡格雷和噻氯匹定有抑制人MSCs分泌VEGF的作用，rhEPO、高浓度普伐他汀、低浓度红景天苷和低浓度噻氯匹定可促进VEGF分泌。这些药物对人MSCs的分化影响不明显。第三部分：促红细胞生成素和普伐他汀对人骨髓间充质干细胞增殖、旁分泌、凋亡、迁移和黏附的影响和作用机制的实验研究[目的]观察促红细胞生成素和普伐他汀干预对人MSCs增殖、VEGF分泌、凋亡、迁移和黏附的影响及相关细胞信号传导通路。[方法]体外培养人MSCs，使用上述药物干预第6代人MSCs，Western blot方法检测作用前后磷酸化细胞外信号调节激酶1／2（extracellular signal-regulated kinase1／2，ERK1／2）、p38促分裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK）及磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）／丝氨酸／苏氨酸激酶（serine／threonine kinase，Akt）蛋白的表达情况，进一步用特异的细胞信号通路抑制剂或激动剂阻断或激活ERK1／2、p38MAPK及PI3K／AKT途径，通过MTT法测定对人MSCs的增殖影响，ELISA法测定细胞VEGF的分泌，用流式细胞仪进行rhEPO和普伐他汀对MSCs的抗凋亡研究，Transwell小室进行细胞迁移实验，并进行细胞黏附性测定。[结果]rhEPO和普伐他汀可使人MSCs的PI3K／Akt通路磷酸化水平升高，抑制p38MAPK通路磷酸化水平，对人MSCs的ERK通路和总Akt、总p38MAPK水平无明显影响。经p38MAPK通路特异激动剂anisomycin预处理后，rhEPO组促增殖作用较前减弱（P＜0．05），而普伐他汀组作用消失，PI3K／AKT通路特异抑制剂Ly294002预处理影响不明显。Ly294002或anisomycin预处理均可使rhEPO促进人MSCs分泌VEGF的作用减弱（P＜0．01），Ly294002预处理可使普伐他汀的这种作用减弱（P＜0．01），但anisomycin作用不明显。rhEPO和普伐他汀能降低H2O2诱导的人MSCs凋亡（P＜0．01），Ly294002预处理后这种作用消失，anisomycin预处理对这种作用影响不明显。经rhEPO或普伐他汀作用后迁移细胞显著增多（P＜0．01），Ly294002预处理后这种作用消失，anisomycin预处理对这种作用影响不明显。经rhEPO或普伐他汀作用后贴壁细胞显著增多（P＜0．01），但Ly294002或anisomycin预处理对这种作用影响均不明显。[结论]rhEPO及普伐他汀可促进人MSCs的增殖、分泌VEGF、迁移和黏附能力，并具有抗凋亡作用。这两种药物的促进增殖作用与其抑制p38MAPK通路有关，p38MAPK通路受抑制也与rhEPO促进VEGF分泌相关，而PI3K／Akt通路的激活参与了它们的刺激VEGF分泌、增强迁移能力以及抗凋亡作用的调控。这两种药物促进黏附能力与PI3K／Akt和p38MAPK通路无关。

论文目录

• 主要缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 引言
• 第一部分:人骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及诱导分化
• 目的
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分:促红细胞生成素、普伐他汀、红景天苷和抗血小板药物对人骨髓间充质干细胞增殖、旁分泌和分化的干预研究
• 研究目的
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分:促红细胞生成素和普伐他汀对人骨髓间充质干细胞增殖、旁分泌、凋亡、迁移和黏附的影响和作用机制的实验研究
• 研究目的
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附件
• 综述
• 论著
• 附录