湖北省鸭肝炎病毒的分离鉴定及生物学特性研究

论文摘要

鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis,DVH）是雏鸭的一种高度致死性的、传播迅速的病毒性疾病,以肝炎为其主要特征。DHV有1型、2型和3型3个血清型。在我国流行的主要是1型鸭肝炎病毒。该病是目前危害养鸭业的主要疾病之一,给养鸭业造成了巨大的经济损失。本研究旨在从湖北地区分离鸭肝炎病毒,并通过鸭胚中和试验、保守区基因序列的测定、动物回归试验、动物保护试验对病毒进行鉴定,通过对鸭胚、雏鸭的致死性试验,对试验雏鸭组织病理变化的观察及组织病变的电镜观察,分析研究鸭肝炎病毒的致病性,同时对分离株进行系统的生物学特性研究,为鸭肝炎的流行病学调查和分类学研究提供素材,并为有效地预防和控制鸭病毒性肝炎提供理论依据。研究的结果如下:1.通过雏鸭尿囊腔接种,对湖北采集的20份疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织进行病原分离,获得2株病毒。将2株分离株经鸭胚传至第5代,收集鸭胚尿囊液病毒测定这些毒株的ELD50分别为10-3.88/0.2ml,10-4.59/0.2ml。经鸭胚中和试验鉴定,2株均为1型鸭肝炎病毒,分别命名为鸭肝炎病毒株DHV-1 JX和DHV-1 DY。2.根据GenBank中的DHV序列,设计引物,经RT-PCR扩增病毒保守区基因组,对其进行序列测定。与Genebank已发表的1型鸭肝炎病毒的核苷酸序列同源性介于92%～97%之间,进化树分析JX株和DY株的亲源关系较远,不在同一分支上。3.JX和DY株病毒对11日龄鸭胚的致死性为100%,人工感染雏鸭的致死率分别为50%和70%。死亡鸭呈角弓反张姿态,剖检主要可见肝脏肿胀,有大量的出血点。镜下观察2株病毒主要侵害雏鸭肝、胰、脾、肾、脑等组织,造成实质器官的病变,肝脏均呈出血性坏死性炎症,DY株胰脏出现明显的坏死灶。肝组织超微结构观察到细胞胞浆的膜状结构中有双层单位膜包绕的圆形似病毒样颗粒,直径约为30～40nm。4.对JX株和DY株病毒的理化特性表现为:病毒在56℃、30min部分灭活,62℃、30min能完全灭活,对乙醚、氯仿、胰酶有抵抗力。同时病毒不凝集鸡、兔、鸭、小鼠的红细胞。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 前言
• 1 历史与分布
• 1.1 1型鸭肝炎
• 1.2 2型鸭肝炎
• 1.3 3型鸭肝炎
• 1.4 1型变异株及新型鸭肝炎
• 2 鸭肝炎病毒病原特点
• 2.1 1型鸭肝炎
• 2.2 2型鸭肝炎
• 2.3 3型鸭肝炎
• 3 流行病学
• 3.1 1型鸭肝炎
• 3.2 2型鸭肝炎
• 3.3 3型鸭肝炎
• 3.4 1型变异株或新型鸭肝炎
• 4 鸭病毒性肝炎的诊断
• 4.1 病毒的分离
• 4.2 病毒中和试验
• 4.3 电镜检测
• 4.4 琼脂扩散试验
• 4.5 凝集试验
• 4.6 荧光抗体技术
• 4.7 酶联免疫吸附试验
• 4.8 胶体金技术
• 4.9 分子生物学诊断技术
• 5 研究的目的和意义
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病料来源
• 1.1.2 DHV阳性血清
• 1.1.3 试验鸭胚、雏鸭
• 1.1.4 仪器设备
• 1.1.5 主要试剂
• 1.1.6 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌培养
• 1.2.2 鸭肝炎病毒毒株分离
• 1.2.2.1 病料的处理
• 1.2.2.2 鸭胚的接种与传代
• 1.2.3 病毒的鉴定
• 1.2.3.1 含病毒的尿囊液对鸭胚的半数致死量
• 1.2.3.2 含病毒的胚体对鸭胚的半数致死量
• 1.2.3.3 鸭胚中和试验
• 1.2.4 保守区基因组序列的测定
• 1.2.4.1 引物的设计
• 1.2.4.2 病毒RNA的提取
• 1.2.4.3 RT-PCR扩增
• 1.2.4.4 目的基因的分子克隆和鉴定、测序
• 1.2.4.5 基因组序列分析和进化树的建立
• 1.2.5 病毒的理化特性
• 1.2.5.1 乙醚敏感试验
• 1.2.5.2 氯仿敏感试验
• 1.2.5.3 耐酸性试验
• 1.2.5.4 胰蛋白酶敏感试验
• 1.2.5.5 耐热性试验
• 1.2.6 病毒对鸭胚的致病性
• 1.2.7 动物回归试验
• 1.2.8 雏鸭保护试验
• 1.2.9 试验雏鸭的组织病理观察
• 1.2.10 试验雏鸭病变组织的电镜观察
• 1.2.11 血凝试验
• 2 结果与分析
• 2.1 细菌分离结果
• 2.2 病毒分离结果
• 2.3 病毒的鉴定结果
• 2.3.1 半数致死量的测定结果
• 2.3.2 鸭胚中和试验结果
• 2.4 保守区基因组序列的测定
• 2.5 病毒的理化特性
• 2.5.1 JX株和DY对乙醚、氯仿、酸、胰蛋白酶的敏感性
• 2.5.2 JX株和DY株对热的敏感性
• 2.6 病毒对鸭胚的致病性
• 2.7 动物回归试验结果
• 2.8 雏鸭保护试验结果
• 2.9 攻毒死亡雏鸭的组织病理变化
• 2.10 肝组织超微结构观察
• 2.11 血凝性
• 3 讨论
• 3.1 病毒分离鉴定
• 3.2 病毒的致病性及组织病理变化
• 3.3 鸭肝炎病毒分离株及其与不同毒株同源性的比较
• 3.4 本研究对湖北省防控鸭病毒性肝炎的意义
• 4 结论
• 参考文献
• 研究生期间发表的论文
• 致谢