植物乳杆菌热应激及热休克蛋白基因表达的动力学研究

论文摘要

益生菌正因其被日趋关注的益生特性而产生商业价值,这主要体现在当它们以足够的活菌数量(至少107 CFU ml-1)被宿主摄入以后,将有利于机体的健康,比如降血压,抗氧化,防炎症,助免疫,以及阻感染。而且,益生菌产品的活菌数越高,越能发挥功效。然而在产品的加工和贮藏时,内含活菌数的稳定性不高成为了目前益生菌产业的技术瓶颈之一,通过热应激、酸应激、盐应激等处理手段来提高益生菌产品的稳定性已初见成效。尤其是热应激,因其便于操作,很适合运用于大规模的食品级的工业生产。本课题针对一株商业化的益生菌植物乳杆菌LpOnlly和其耐热株LpOnlly-Hr的热应激展开。实验比较研究了LpOnlly在不同条件下热适应时,其细胞热耐受的动力学和热休克蛋白（HSP）基因表达的动力学之间的联系和差异,从而揭示影响植物乳杆菌热应激的因素和其内在机理。实验使用45℃热适应和以下几种条件的组合:三种细胞生长相（对数中期、平台前期、平台期）,两种热适应基质（原始发酵液和新鲜培养基）和两种菌株表型（原养型和耐热型）。选取的HSP基因则包括dnaK操纵子、groESL操纵子、小热休克蛋白（sHSP）基因、属于CtsR调节子的蛋白酶基因等4大类,共12条。为了研究热适应时间长短对细菌的影响,实验还对分别热适应30和90分钟的LpOnlly对数中期细胞进行37℃复苏培养,也考察其细胞的热耐受动力学和HSP基因表达动力学。热适应和复苏的实验均采用了60分钟的保温时间和6分钟的测定间隔,评价热耐受所用的致死条件为58℃1.5分钟。结果显示,首先,对于实验中的热适应条件,所有样本（除了平台期原液）在热适应过程中的热耐受动力学曲线都呈逐渐升高的S形,且热耐受在热适应30分钟后进入稳定期,本课题把这个节点称为临界时间。此外,一般地,如果细胞固有的热耐受高或用新鲜培养基作热适应基质,会降低热适应时热耐受的可诱导性。其次,热适应过程中的HSP基因表达动力学曲线表现为3种模式,“模式一”为驼峰形,即有一个表达峰值,主要出现在24～36分钟,对应着热耐受动力学的临界时间,说明此节点存在关键的转录调控。“模式一”代表了多数HSP基因的表达形态。热适应超过临界时间后,“模式二”和“模式三”的HSP基因表达却没有像“模式一”那样马上减少,说明存在不同的转录调控。而且有时,实验的热适应条件改变,这两种少见的表达模式会转变成“模式一”。此外,一般地,如果细胞固有的HSP基因的表达高或用新鲜培养基作热适应基质,会降低热适应时HSP基因表达的可诱导性。用对数中期的LpOnlly和LpOnlly-Hr原液热适应时,hrcA操纵子和CtsR调节子的表达还体现了hrcA和ctsR的阻遏调控。最后,热压力消失后,热适应90分钟（长期）的LpOnlly细胞比热适应30分钟（短期）能维持更久的热耐受。同时,短期和长期热适应的细胞在复苏时,HSP基因的表达都呈指数衰减,但前者的衰减速率快于后者,这与热耐受动力学有明显相关性。至衰减末期,长期热适应的细胞中,绝大多数HSP基因的表达高于短期热适应的细胞。另外,实验中附带验证了LpOnlly经过热适应的种子通过无热压力的正常传代后,所获得的热耐受基本消失。综合热适应和复苏时的热耐受动力学和HSP基因表达动力学可知,首先,进行热适应实验时,可以先确定临界时间,然后根据需要选择合适的热适应时间。如果要获得一定热适应条件下细胞的最高热耐受,那么热适应至临界时间就可达到。但如果要使细胞在热压力消失后还能保持较长时间的热耐受,那么采用比临界时间更长的热适应时间会有更好的效果。当然,如果要研究热应激反应的转录层面,还得根据所研究的基因的表达动力学中比较特殊的时间节点来选择热适应时间。其次,细胞经过热压力的诱导产生了较高的热耐受,却未必伴随着较高的HSP基因表达,说明通过HSP基因的表达来提高细胞的热耐受似乎是一种初步的策略,之后细胞将转而依赖其他防御途径来维持应激效果,比如产生更多的HSP修复损伤,减少细胞膜的流动性,改变细胞内部pH等等。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 益生菌概述
• 1.1.1 益生菌概念
• 1.1.2 适用于益生菌制品的菌株
• 1.1.3 益生菌的保健功能
• 1.1.3.1 预防和治疗腹泻
• 1.1.3.2 预防癌症和肿瘤生长
• 1.1.3.3 调节免疫
• 1.1.3.4 降血脂功能
• 1.2 益生菌的发展趋势
• 1.2.1 益生菌的应用
• 1.2.2 工业开发存在的问题
• 1.3 益生乳酸细菌
• 1.3.1 乳酸杆菌简介
• 1.3.2 植物乳杆菌
• 1.4 乳杆菌的应激研究
• 1.4.1 热应激
• 1.4.2 酸应激
• 1.4.3 盐应激
• 1.5 实时反转录PCR 技术
• 1.5.1 实时PCR 的原理
• 1.5.2 用SYBR Green I 检测PCR
• 1.5.3 实时PCR 的影响因素
• 1.5.4 实时PCR 的应用
• 1.5.5 结和2-ΔΔCt 法相对定量
• 第二章 课题意义及方案
• 2.1 课题意义
• 2.2 实验方案
• 第三章 热适应种子的热耐受传代研究
• 3.1 实验准备
• 3.1.1 仪器设备
• 3.1.2 药品试剂
• 3.1.3 实验材料
• 3.2 实验方案
• 3.2.1 测定菌株的生长曲线
• 3.2.2 测定菌株的D 值曲线
• 3.2.3 优化热适应的时间
• 3.2.4 种子热耐受的传代能力
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 菌株的生长和D 值曲线
• 3.3.2 优化热适应的时间
• 3.3.3 种子热耐受的传代能力
• 第四章 热适应的动力学研究
• 4.1 实验准备
• 4.1.1 仪器设备
• 4.1.2 药品试剂
• 4.1.3 实验材料
• 4.2 实验方案
• 4.2.1 筛选耐热株
• 4.2.2 热适应时细胞的热耐受变化
• 4.2.3 抽提热适应样本的总RNA
• 4.2.4 对总RNA 进行定性电泳
• 4.2.5 反转录总RNA 为总cDNA
• 4.2.6 热适应时HSP 基因的表达变化
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 筛选耐热株
• 4.3.2 热适应时细胞的热耐受变化
• 4.3.3 抽提热适应样本的总RNA
• 4.3.4 实时PCR 的预实验
• 4.3.5 热适应时HSP 基因的表达变化
• 第五章 热适应后复苏的动力学研究
• 5.1 实验准备
• 5.1.1 仪器设备
• 5.1.2 药品试剂
• 5.1.3 实验材料
• 5.2 实验方案
• 5.2.1 复苏时细胞的热耐受变化
• 5.2.2 复苏时HSP 基因的表达变化
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 复苏时细胞的热耐受变化
• 5.3.2 复苏时HSP 基因的表达变化
• 第六章 结论和创新点
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表或投稿的学术论文