论文摘要
高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1,HMGB1）是高迁移率族（high mobility group,HMG）蛋白家族成员之一,1973年英国科学家Goodwin在牛胸腺细胞中首次发现,因其在聚丙烯酰胺电泳中的高迁移率得名,它是一种含量丰富、分子量小、高度保守的染色质相关非组蛋白。HMGB1分布十分广泛,多种器官细胞（如淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等）中均有表达,并位于大多数细胞的胞核和胞浆中。最初发现其作为核因子直接参与基因表达调控,近年陆续发现其具有丰富的生物学功能,包括参与脑的发育和神经细胞生长、纤维蛋白溶酶原的活化、肿瘤细胞转移、免疫细胞分化以及广泛参与全身的炎症反应和组织损伤等。脓毒症目前仍然是临床危重患者的重要死因之一,其死亡率高达30～70%。研究表明,HMGB1作为重要的炎症介质在全身炎症反应过程中起重要作用。致炎刺激脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）等激活的单核/巨噬细胞和内皮细胞经8～32 h延迟后释放HMGB1,同时坏死组织细胞崩解也释放出大量的HMGB1。释放到细胞外的HMGB1分子通过进一步激活单核或内皮等细胞,引起大量炎症因子和黏附分子的表达和释放,导致并参与了包括脑组织、肺、胃肠道、关节、心脏等多种脏器的炎症损伤以及广泛的全身性炎症反应甚至死亡。由此可见,HMGB1在炎症反应过程中起着重要的中枢作用。HMGB1在大多数细胞和组织中都控制在一个基础的表达水平,但HMGB1并不是组成型表达,而是被严格调控的。在增殖组织和活化的分裂细胞,其表达水平可以提高2倍,在雌激素刺激的乳癌细胞中其表达量也可提高2倍以上;在用顺氯氨铂治疗的癌症中,其表达水平也升高,且能够增强顺氯氨铂的抗癌效果。不同刺激在不同细胞、不同种系可能通过不同的信号通路诱导HMGB1的表达,相关的调控机制也不尽相同。Lum等人克隆并分析了人HMGB1基因的的上游区域和第一个内含子,发现在乳癌（human breast adenocarcinoma cell line,MCF-7）细胞中人HMGB1基因的转录起始于第一个内含子—外显含子交界处上游57个核苷酸的位点。人HMGB1基因的表达受TATA框缺失的启动子的调控,这一启动子的活性比猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40,SV40）强18倍之多。其中的沉默子能抑制启动子的活性至原来的六分之一,基因中的第一个内含子包含有增强子,能使此启动子的活性增强2～3倍,因此我们设想HMGB1在此增强子的作用下其表达水平能够明显的提高,而我们在大多数细胞中观察到HMGB1的基础表达量可能是由于沉默子抑制作用。参与内毒素休克中HMGB1表达的信号调控通路也仅仅有一些初步的研究。Gardella研究发现脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein,LBP）/白细胞分化抗原14（cluster of differentiation 14,CD14）作为LPS的结合受体,与HMGB1的基因表达密切相关,提示LPS可能通过LBP/CD14及其下游的信号激活单核/巨噬细胞,HMGB1从核内移至胞浆中的细胞器,然后通过溶酶体的自溶、胞吐作用将HMGB1释放出来。乙基丙酮酸通过抑制细胞外信号调控激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1/2,ERK1/2）磷酸化和抑制巨噬细胞的活性也可以抑制HMGB1的释放。Wang等人发现通过抑制蛋白酪氨酸激酶（Janusprotein tyrosine kinase,JAK）/信号转导子和转录激活子（signal transducer andactivator of transcription,STATs）通路活化可明显下调肝脏组织HMGB1 mRNA表达,从而有助于减轻脓毒症大鼠的急性肝损伤。胥彩林等人则发现核因子κB（nuclear factor-kappaB,NF-κB）抑制剂能显著抑制内毒素休克动物组织（肝、肺、肾）HMGB1 mRNA的表达,使各脏器损伤和功能得到明显改善。由此可知上述信号分子所在信号通路可能参与了HMGB1的表达调控,但确切的机制目前仍不清楚。基因表达的调控是细胞对外部或内部的刺激发生应答的方式,这是一个高度复杂,精确调控的过程,基因表达调控可以在复制、转录、转录后、翻译和翻译后多等级水平上进行,但DNA转录起始调控是基因表达调控的关键控制点,即在一定时间、空间上,多种调节蛋白作用于特异的基因启动子的复杂过程,其本质是DNA—蛋白质/蛋白质—蛋白质间广泛的相互作用。另外,人们发现,在基因表达调控过程中,往往不是单个因素起作用,而是多种调节因素相互交织,相互影响,形成复杂的调控网络,最终使基因表达调控呈现出一种高度的有序性。鉴于这种广泛的蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA相互作用网络参与其中,相关研究策略也层出不穷。其中,启动子DNA结合蛋白的研究是从转录水平上研究基因表达的调节,以寻找新的蛋白质为手段,以了解其转录调节作用为目的,从而最终为阐明某些疾病的发病机制及基因治疗奠定基础。目前,对启动子DNA结合蛋白的研究方法可分为两大类:第一类是细胞内法,以已知启动子DNA序列筛选出与其相结合的蛋白,通过生物信息分析来确定该蛋白质;第二类是细胞外法,即在体外用重组的已知蛋白质与启动子DNA结合。二者各有其自身的优势,又有各自的缺陷。我们将以上二者结合应用,以期达到既能找到未知调控蛋白,又能找到该蛋白质的精确的结合位点并证实二者结合特异性的目的。由此,我们以小鼠肝脏基因组DNA为模板,扩增小鼠HMGB1基因5’非编码区（noncoding region,NCR）1378 bp长的调控序列,将其插入pDsRed1-1红色荧光素酶报告基因载体上。应用脂质体介导基因共转染技术将质粒pDsRed1-1/HMGB1p导入NIH/3T3细胞,给予TNF-α持续刺激,观察红色荧光蛋白表达情况,证明所得到的启动子序列具有转录活性,为进一步研究HMGB1基因表达信号调控机制提供一个方便、可靠的工具。同时,从“组学”的角度和活体组织水平,根据DNA—蛋白质相互作用的原理,基于生物素—链亲和素系统、磁珠分离μMACSTM系统,结合生物质谱技术筛选了内毒素休克小鼠的肝脏组织中与HMGB1启动子发生相互作用的结合蛋白。利用末端生物素（biotin）标记的HMGB1启动子区引物,PCR扩增制备带biotin标记的HMGB1启动子探针HMGB1p-biotin。制备BALB/c小鼠的内毒素休克模型,提取肝脏组织核蛋白,与扩增的HMGB1p-biotin探针行结合反应,再以标记有链亲和素（streptavidin）的磁珠分离HMGB1p-biotin—蛋白反应复合物,不同盐浓度缓冲液洗脱结合的蛋白,使用聚丙稀酰胺凝胶电泳分离洗脱的样品蛋白,并对凝胶行改良考染显色,比较内毒素休克组与正常对照组的差异条带（DNA pull-down assay）。结果表明,在肝脏组织胞核中,调出11个差异蛋白,这些蛋白可能直接或间接参与了内毒素休克小鼠肝脏中HMGB1的表达调控。其中有10个蛋白在LPS作用后与HMGB1启动子结合增加,提示这些蛋白可能参与了LPS作用后HMGB1的转录调控,多次重复均得到相同的结果。对结果中出现的11个差异条带进行质谱（mass spectrometry,MS）鉴定,根据得到的肽指纹图谱,利用Mascot查询软件搜索NCBI数据库,综合分析后得到7个与转录调控有关的蛋白分子,分别为组蛋白2A（histone 2A,H2A）、组蛋白2B（histone 2B,H2B）、组蛋白3（histone 3,H3）、组蛋白4（histone 4,H4）、S100A9蛋白（myeloid-related protein 14,MRP14）、双功能过氧化物酶（peroxisomalbifunctional enzyme,Ehhadh）、乙酰辅酶A酰基转移酶2（acetyl-Coenzyme Aacyltransferase 2,ACox2）。其中,H3作为染色体结构中高度保守的一类核心组蛋白,主要通过其乙酰化水平的调节控制基因转录的“开”和“关”;乙酰辅酶A酰基转移酶则参与氨基酸残基乙酰基化反应、MS鉴定得到的这些结果充分说明内毒素休克小鼠中HMGB1基因的表达调控可能受到了多种因素的影响,这些因素相互协调,共同作用从而影响HMGB1基因的表达调控。通过以上研究,我们得出:一、克隆出具有启动基因表达活性的HMGB1启动子DNA片段;二、构建了红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1/HMGB1p,并在NIH/3T3细胞内证实该启动子具有启动红色荧光蛋白表达的活性,可有效用于HMGB1基因表达信号调控机制的研究;三、利用生物素-链亲和素、磁珠分离μMACSTM系统成功筛选到参与HMGB1基因调控的转录因子,在胞核蛋白中至少有11个蛋白可能参与了这一过程,并利用生物质谱技术鉴定相关蛋白分别为H2A、H2B、H3、H4,S100A9,Ehhadh,ACox2。本研究利用DNA—蛋白质相互作用的原理,为从“转录组学”的角度分析基因的转录表达调控过程及其机制开创了新的思路。同时差异条带的出现说明在内毒素休克小鼠HMGB1的转录调控发生了较为复杂的变化,可能有多种核蛋白或转录因子参与了这一过程。这些蛋白的鉴定对于我们深入理解HMGB1基因表达调控有重要的意义,同时也将为临床治疗内毒素休克提供新的理论依据及可能的治疗靶点。