含CpG基序重组质粒的构建及其遗传稳定性研究

论文摘要

以对鸡外周血单核细胞（PBMC，peripheral blood mononuclear cells）具有最佳刺激活性的CpG基序（CpG Motif）为基础，人工合成含有5拷贝此种基序的寡聚脱氧核苷酸（oligodexynucleotides，ODN）并在两端设计2对酶切位点，通过2次定向克隆和3次平末端克隆，将其分步串联连接入pcDNA3.0载体中的多克隆位点中，获得了一组含有不同拷贝数（5、10，20，40，60拷贝）CpG基序、对鸡PBMC具有免疫刺激活性的重组质粒。应用淋巴细胞分离液分离AA肉鸡PBMC，以所构建的、富含CpG基序的三种重组质粒pcDNAACpG—-3，pcDNAACpG-4，pcDNAACpG-5为刺激原，LPS作为阳性对照，进行体外淋巴细胞转化试验，用MTT比色法来测定淋巴细胞的增殖能力和代谢强度。通过比较含有不同拷贝数CpG基序重组质粒、同一重组质粒的不同浓度对鸡PBMC的免疫刺激效果，筛选出对鸡具有最佳免疫刺激活性的重组质粒及其剂量。将重组菌在含氨苄青霉素的固体LB培养基中连续传30代，并对不同代次重组质粒的遗传稳定性进行鉴定。结果表明，在30代内，重组质粒pcDNAACpG-5的拷贝数、CpG ODN序列及氨苄青霉素抗性都保持稳定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 CPG ODN的研究进展
• 1.1.1 天然免疫与模式识别
• 1.1.2 CpG ODN的作用机理
• 1.1.3 CpG ODN的类型
• 1.1.4 CpG ODN的细胞免疫作用
• 1.1.5 CpG ODN在免疫治疗中的应用
• 1.1.6 展望
• 1.2 DNA疫苗的优化策略
• 1.2.1 优化外源基因的表达
• 1.2.2 增加DNA疫苗的免疫原性
• 1.2.3 免疫程序的优化
• 1.2.4 结语
• 第二章 对鸡具有免疫刺激活性的CPG重组质粒的构建
• 2.1 试剂与材料
• 2.1.1 试剂与材料
• 2.1.2 质粒与菌株
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 LB琼脂板和Amp抗性LB琼脂板的制备:
• 2.2.2 感受态大肠杆菌DH5α的制备
• 2.2.3 pcDNAACpG-1重组质粒的构建
• 2.2.4 pcDNAACpG-2重组质粒的构建
• 2.2.5 pcDNAACpG-3重组质粒的构建
• 2.2.5 pcDNAACpG-4重组质粒的构建
• 2.2.6 pcDNAACpG-5重组质粒的构建
• 2.3 讨论
• 第三章 PCDNAACPG系列重组质粒免疫刺激活性的初步研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 重组质粒及其工程菌
• 3.1.2 试剂与仪器
• 3.1.3 溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 鸡外周血单个核细胞（PBMC）的制备
• 3.2.2 淋巴细胞活力检测和计数
• 3.2.3 鸡外周血单个核细胞增殖试验
• 3.2.4 MTT比色法测定淋转效果
• 3.2.5 结果计算
• 3.3 讨论
• 第四章 含PCDNAACPG-5重组菌遗传稳定性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 重组质粒拷贝数稳定性试验
• 4.2.2 CpG序列在重组质粒中稳定性试验
• 4.2.3 重组菌氨苄青霉素抗性稳定性试验
• 4.3 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历