肠道病毒71型类病毒颗粒在昆虫细胞Sf9中的表达

论文摘要

肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）是手足口病（Hand, Foot, and Mouth Disease, HFMD）最重要的病原体。对于手足口病目前尚无有效治疗的药物,疫苗将成为预防EV71感染最有效的手段之一。用疫苗预防传染性疾病包括传统技术制备的减毒活疫苗和灭活疫苗,以及现代生物技术研制的新型疫苗。类病毒颗粒（Virus Like Particle, VLP）疫苗是新型疫苗中基因工程亚单位疫苗免疫原性最理想的一种形式。类病毒颗粒是由病毒外壳蛋白质所组成的不含遗传物质的壳状结构。由于其内部没有核酸,自身不具备复制性,所以作为疫苗安全性高,同时类病毒颗粒具有相对较完整的病毒结构,故其免疫原性强,这些优点使类病毒颗粒疫苗成为基因工程疫苗研究的热点。重组杆状病毒是一个很有前景的外源基因表达系统,能高效表达抗原性、免疫原性和生物活性较好的蛋白质,并能形成VLP。研制VLP除了有效的表达系统以外,还需要选择合适的抗原基因。EV71主要的抗原基因P1在未加工时免疫原性有限,当被蛋白酶3CD切割成病毒衣壳蛋白暴露在病毒表面后,免疫原性得到提高。基于以上原理及设想,本研究构建了含有EV71的P1基因和3CD基因的嵌合型重组质粒pFastBac Dual-P1-3CD,然后转化DH10感受态细胞,经同源重组得到重组杆状病毒质粒Bac-P1-3CD.将Bac-P1-3CD转染Sf9昆虫细胞以获得重组杆状病毒,收获感染重组杆状病毒的Sf9细胞,用SDS-PAGE, Western blot和电镜对基因表达产物进行检测和分析,评价了P1和3CD基因在昆虫细胞中表达,以及3CD蛋白酶对P1蛋白的切割作用,以及切割后病毒蛋白成分的抗原性。实验结果表明,经同源重组获得了在Sf9细胞中包装的重组杆状病毒；表达产物用SDS-PAGE检测到39kDa、32kDa、26kDa三条特异蛋白条带,与EV71 VP1、VPO、VP3蛋白大小相近,提示重组杆状病毒表达了P1蛋白和3CD蛋白酶,并且3CD蛋白酶切割了P1蛋白；Western blot检测到能与抗EV71血清反应的特异性条带,与EV71 VP1大小相近,证明表达产物为EV71特异性抗原；电镜下观察到形态学典型的EV71类病毒颗粒。这项研究证实了EV71 P1和3CD基因可以以嵌合形式通过重组杆状病毒在昆虫细胞中共表达,3CD蛋白酶可以切割P1蛋白得到VP1抗原成分,并能形成类病毒颗粒。这些研究结果不仅对研制EV71类病毒颗粒疫苗具有重要意义,也对研究小RNA病毒结构蛋白与非结构蛋白的相互作用提供了理论依据与技术手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1. 手足口病流行病学
• 2. 肠道病毒71型
• 3. 昆虫细胞-杆状病毒表达系统
• 4. 类病毒颗粒及相关疫苗
• 5. 研究目的和预期
• 1. 实验材料
• 1.1 细胞、病毒、菌株及质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 基因
• 2. 实验方法
• 2.1 引物设计和合成
• 2.2 获得P1和3CD基因片段
• 2.2.1 P1和3CD基因的PCR扩增
• 2.2.2 PCR结果鉴定及其产物胶回收
• 2.2.3 P1和3CD基因的胶回收产物双酶切
• 2.2.4 P1和3CD酶切产物的鉴定和胶回收
• 2.3 构建供体质粒pFastBac Dual-P1-3CD
• 2.3.1 pFastBac Dual质粒双酶切（Sal Ⅰ& HindⅢ）产物鉴定和胶回收
• 2.3.2 DH5α感受态细胞的制备
• 2.3.3 P1酶切产物和pFastBac Dual质粒酶切产物的连接及转化
• 2.3.4 获得pFastBac Dual-P1质粒
• 2.3.5 pFastBac Dual-P1质粒双酶切（Sma Ⅰ& Kpn Ⅰ）产物鉴定和胶回收
• 2.3.6 3CD酶切产物和pFastBac Dual-P1质粒酶切产物的连接、转化及鉴定
• 2.4 构建穿梭质粒Bac-P1-3CD
• 2.4.1 DH10感受态细胞的制备
• 2.4.2 pFastBac Dual-P1-3CD转化DH10感受态细胞
• 2.4.3 重组杆状质粒的提取
• 2.4.4 重组杆状质粒的鉴定
• 2.5 昆虫细胞Sf9的培养
• 2.6 重组杆状病毒的包装
• 2.6.1 转染昆虫细胞Sf9
• 2.6.2 重组杆状病毒鉴定
• 2.6.3 收获重组杆状病毒
• 2.6.4 重组杆状病毒的扩增
• 2.7 目的基因表达的检测
• 2.7.1 SDS-PAGE
• 2.7.2 Western blot
• 2.7.3 类病毒颗粒的电镜检测
• 3. 实验结果
• 3.1 P1基因和3CD基因的获得
• 3.2 pFastBac Dual-P1质粒的构建
• 3.3 pFastBac Dual-P1-3CD质粒的构建
• 3.4 Bac-P1-3CD质粒的构建
• 3.5 重组杆状病毒的包装
• 3.6 目的基因表达检测
• 3.7 EV71类病毒颗粒检测
• 4. 讨论
• 4.1 重组杆状病毒的包装
• 4.2 目的基因的表达与EV71类病毒颗粒检测
• 4.3 重组杆状病毒的滴度测定
• 4.4 EV71类病毒颗粒的纯化
• 5. 小结
• 6. 展望
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介