啤酒酵母ECM25基因敲除对啤酒风味稳定性的影响

论文摘要

风味稳定性一直是啤酒的重要质量指标之一,啤酒在贮存过程中的老化也一直为酿造界所关注。啤酒酵母是啤酒生产的灵魂,是对啤酒风味和风味稳定性具有决定作用的因素之一。啤酒是非常复杂的体系,其中有些化合物会通过一系列反应,使啤酒风味不断变化,最终导致风味老化。啤酒生产时酵母合成和分泌的谷胱甘肽（GSH）可以与自由基反应,减少老化前驱物质和老化物质的含量,延长啤酒保鲜期,提高啤酒风味稳定性。酵母X号染色体上的ECM25基因的缺失,会影响GSH的运输途径,从而改变GSH的内稳态并导致其过量分泌。本文先利用PCR介导基因破坏技术,以pUG6为模板,设计含有与ECM25基因两侧序列同源的长引物,构建了带有卡那抗性基因（KanMX）破坏盒,转化啤酒酵母G-03,获得一株G-03/a重组菌,遗传稳定性良好,测序结果证实ECM25基因敲除是成功的。然后对重组菌G-03/a和原菌G-03进行生理生化性能和摇瓶及EBC管发酵性能的比较。着重考察它们在有氧条件和酿造条件下胞内外GSH产量和主酵液、成品啤酒的抗老化能力。有氧条件下11℃和28℃培养时重组菌G-03/a的胞外GSH分泌量在对数生长期中期分别比原菌高21.4% （P<0.01）和14.7% （P<0.01）。摇瓶连续发酵3代后,与原菌株相比,重组菌G-03/a发酵液、成品酒中GSH含量分别提高32.1% （P<0.05）和13.8% （P<0.05）,发酵液和成品啤酒SI系数分别提高7.7% （P<0.05）和5.3% （P<0.05）,成品啤酒RSV值提高45.0% （P<0.01）。EBC管发酵6 d后,与原菌株相比,重组菌G-03/a发酵液中GSH含量提高34.0% （P<0.01）。重组菌G-03/a与G-03所酿制的成品啤酒的常规指标没有显著差别（P>0.05）,品尝风味也基本一致。表明G-03/a是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母,能够提高啤酒的风味稳定性。啤酒酵母工业菌株一般为多倍体菌株,本研究由G-03敲除一条ECM25基因的重组菌G-03/a是一株遗传性状稳定的优良啤酒酵母。但是用于基因破坏的KanMX对于啤酒酵母是一个外源基因,因此还需要对其进行敲除才可以用于实际生产。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 啤酒老化及风味稳定性
• 1.1.2 啤酒老化化合物
• 1.1.3 啤酒中的自由基
• 1.1.4 抗氧化物
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 谷胱甘肽的研究进展
• 1.2.2 啤酒酵母S. carlsbergensis 的倍性及其染色体组成的复杂性
• 1.2.3 酵母的基因破坏技术
• 1.3 研究目的和意义及主要研究内容
• 1.3.1 研究目的和意义
• 1.3.2 主要研究内容
• 第二章 PCR介导破坏啤酒酵母ECM25 基因
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要实验材料
• 2.2.2 主要实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 啤酒酵母ECM25 基因的获得
• 2.3.2 PCR产物的TA克隆以及序列测定
• 2.3.3 基因中断盒ECM25-KanMX-ECM25 的构建
• 2.3.4 酵母菌的转化以及转化子的验证
• 2.3.5 重组菌G-03/a的遗传稳定性分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 重组菌G-03/a发酵性能及生理特性
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要实验材料
• 3.2.2 主要实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 重组菌与原菌的生长性能比较
• 3.3.2 重组菌与对照菌在11℃和28℃下有氧生长及胞内外GSH的产量
• 3.3.3 重组菌与对照菌的生理性能比较
• 3.3.4 重组菌和对照菌发酵性能及主要老化指标比较
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 重组菌G-03/a EBC管发酵试验
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要实验材料
• 4.2.2 主要实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 EBC管发酵过程中细胞浓度及细胞干重
• 4.3.2 EBC管发酵过程中pH、双乙酰及α-氨基氮的跟踪
• 4.3.3 EBC管发酵过程中胞内外GSH的跟踪
• 4.3.4 EBC管发酵指标
• 4.4 本章小结
• 主要结论与展望
• 主要结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表论文