载HGF的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子在肝细胞移植治疗急性肝衰竭大鼠中作用研究

论文摘要

目的:观察载肝细胞生长因子（HGF）的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖（PLA-O-CMC）纳米粒子培养的大鼠肝细胞腹腔内移植对急性肝衰竭（ALF）大鼠的治疗效果并探讨其作用机制。方法:D-氨基半乳糖（D-gal）腹腔内注射（1.2g/kg）制作大鼠ALF模型,48h后分别将5ml（含5.0×107个）常规胶原培养24h的大鼠肝细胞（Ⅰ组）、PLA-O-CMC纳米粒子培养24h的大鼠肝细胞（Ⅱ组）、载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子培养24h的大鼠肝细胞（Ⅲ组）移植到模型大鼠腹腔内,以5ml PLA-O-CMC纳米粒子培养24h的大鼠肝细胞腹腔移植加每日静脉注射HGF 10μg/kg×7d（Ⅳ组）和5ml混合细胞培养液腹腔内注入（Ⅴ组）作为对照。观察受体大鼠14d存活率、肝功能、肝脏的病理变化及有丝分裂指数和肝细胞超微结构变化;观察移植肝细胞病理变化。免疫组化法检测受体肝Ki-67抗原、增殖细胞核抗原（PCNA）和溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）掺入标记指数。酶联免疫法检测受体大鼠血清和肝组织HGF浓度。流式细胞仪检测受体大鼠肝细胞增殖指数以及培养和移植肝细胞凋亡率、坏死率及存活率。结果:移植后14d ALF大鼠的存活率:Ⅰ～Ⅴ组分别为50.00%,68.75%,81.25%,75.00%,18.75%。各移植组高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。移植后24h始,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组各项肝功能指标开始好转,与Ⅴ组相比差异有统计学意义（P<0.05）;移植5d时差异最为明显,Ⅲ组ALB显著高于其余各组（P<0.05）;至移植后7d,各组间除ALT外,差异无统计学意义（P>0.05）。Ⅲ组的肝功能和肝脏病理损害恢复最快、最好,其次为Ⅳ组、Ⅱ组、Ⅰ组,Ⅴ组恢复最慢、最差。Ⅲ组移植肝细胞存活时间较长,炎症浸润较轻。Ⅲ组肝小叶结构恢复较快,肝细胞电镜下核分裂相明显,粗面内质网密集,线粒体较多。移植后各组均有肝再生表现,移植组好于对照组,纳米组好于非纳米组。Ⅲ组有丝分裂指数、Ki-67、PCNA、BrdU标记指数、肝细胞增殖指数均高于其余各组,部分时段的差异有统计学意义（P<0.05）。各组HTx后血清和肝组织HGF浓度均有升高,3d时增高最为明显。Ⅲ组肝组织HGF浓度高于其他各组,Ⅳ组血清HGF浓度高于其他各组（P<0.05）。随着时间延长,各组肝细胞活率下降,凋亡率和坏死率上升,Ⅲ组肝细胞活率最高,凋亡率最低。移植后3d时差异最为明显,Ⅲ组和Ⅳ组的肝细胞活率显著高于Ⅰ组且Ⅲ组高于Ⅱ组,而Ⅲ和Ⅳ组凋亡率显著低于Ⅰ组,且Ⅲ组低于Ⅱ组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:应用载HGF的PLA-O-CMC纳米粒子培养的大鼠肝细胞腹腔内移植治疗D-gal诱导的ALF大鼠能显著逆转肝功能和提高生存率;其通过促进受体肝再生,抑制移植肝细胞凋亡,起到较好的治疗作用。

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