骆驼成纤维细胞构建异质克隆胚

论文摘要

本研究构建了绵羊体细胞-绵羊卵母细胞重组胚、骆驼体细胞-绵羊卵母细胞重组胚和骆驼体细胞-牛卵母细胞重组胚三种重组胚,并研究了它们早期的发育情况。首先用不同的方法体外培养骆驼和绵羊皮肤成纤维细胞,作为核供体,然后体外成熟牛和绵羊的卵母细胞作为受体,最后构建重组胚。 研究表明,37℃、5%CO2、饱和湿度下,10%NCS 的 DMEM-F12 培养液适宜于骆驼皮肤成纤维细胞体外生长,小组织块直接培养法可获得骆驼皮肤成纤维细胞,本实验对比了三种方法并找到最佳方法;传代培养时,酶消化法和反复贴壁法可分离纯化骆驼皮肤成纤维细胞,用 D-Hanks 为缓冲液配制的胰蛋白酶适合骆驼皮肤成纤维细胞的消化。 本研究发现,用离子霉素联合 6-DMAP 能有效地激活牛和绵羊的卵母细胞,然后以 10%FBS+SOFaa+颗粒细胞为发育微环境培养,其囊胚率分别为 27.34%和 46.08%;成熟卵母细胞在不同激活电压下进行激活,脉冲时间为 20 μsec 二次,间隔 0.5 秒,再用 6-DMAP 辅助激活 4h 后,置于 SOFaa+10%FBS+颗粒细胞的微环境中培养。当电压从 1000V/cm 到 2400V/cm 之间激活牛卵母细胞时,均可获得囊胚,但只有电压在1400V/cm 附近时,才可以使得囊胚率最高。当电压从 1000V/cm 到 2200V/cm 之间激活绵羊卵母细胞时,均可获得囊胚,但只有电压在 1400V/cm 附近时,才可以使得囊胚率最高。 带下注射结合电融合能获得融合的重构胚。绵羊体细胞与绵羊卵母细胞构建重组胚可以发育到囊胚期;骆驼体细胞与绵羊卵母细胞构建重组胚可以发育到桑葚胚时期;而骆驼体细胞与牛卵母细胞构建重组胚可以发育到 8-16 细胞胚胎时期。

论文目录

• 1 引言
• 2 综述
• 2.1 动物核移植研究进展
• 2.1.1 核移植和克隆的相互关系
• 2.1.2 动物核移植研究发展现状
• 2.2 异种动物细胞核移植研究进展
• 2.2.1 异种动物细胞核移植研究发展现状
• 2.2.2 异种动物核移植应用前景
• 2.2.3 异种动物核移植存在的问题
• 2.3 细胞核重编程机理的研究进展
• 2.3.1 DNA 的甲基化及抑制性染色质的形成
• 2.3.1.1 细胞分化过程中抑制性染色质的形成与DNA 甲基化
• 2.3.1.2 核的重编程过程中染色质结构成分的变化和 DNA 的去甲基化
• 2.3.2 细胞周期与核重编程的关系
• 2.3.2.1 细胞周期调控
• 2.3.2.2 MPF 在细胞周期中的变化及其调节细胞周期的机理
• 2.3.2.3 MPF 在核重编程中的作用
• 2.3.2.4 供核与受体胞质细胞周期的协调
• 3 实验研究
• 3.1 骆驼皮肤成纤维细胞系的建立
• 3.1.1 原代培养
• 3.1.2 传代培养
• 3.1.3 细胞生长曲线
• 3.1.4 染色体数目检查
• 3.2 卵母细胞的准备及孤雌激活
• 3.2.1 牛卵母细胞的体外成熟和激活
• 3.2.1.1 卵巢卵母细胞的采集
• 3.2.1.2 卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养
• 3.2.1.3 成熟卵的检查
• 3.2.1.4 牛卵母细胞的孤雌激活及发育培养
• 3.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟和激活
• 3.2.2.1 卵巢卵母细胞的采集
• 3.2.2.2 卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养
• 3.2.2.3 成熟卵的检查
• 3.2.2.4 绵羊卵母细胞的孤雌激活及发育培养
• 3.3 异质克隆胚的构建
• 3.3.1 成熟卵母细胞的去核
• 3.3.2 核供体的准备
• 3.3.2.1 骆驼皮肤成纤维细胞的准备
• 3.3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的准备
• 3.3.3 核移植
• 3.3.4 重组胚的激活及体外培养
• 3.4 结果
• 3.4.1 骆驼皮肤组织的原代和传代培养
• 3.4.2 骆驼皮肤成纤维细胞的生长曲线
• 3.4.3 骆驼的染色体
• 3.4.4 不同激活电压对牛卵母细胞孤雌激活的影响
• 3.4.5 牛卵母细胞的化学激活
• 3.4.6 不同激活电压对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响
• 3.4.7 绵羊卵母细胞的化学激活
• 3.4.8 重组胚的融合及其发育
• 3.5 讨论
• 3.6 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 英文缩略词
• 主要仪器与试剂
• 作者简介