论文摘要
目的:头颈肿瘤也同其它大多数实体肿瘤一样,瘤体内的部分细胞处于乏氧环境之中,因而降低了其对放疗的敏感性。目前乏氧引起的头颈肿瘤对放疗抵抗性增加的确切机制尚不明了,因此有必要深入研究乏氧同头颈肿瘤放疗抵抗的关系。本实验将模拟在体肿瘤细胞微环境,体外建立不同氧供状态下的细胞模型,探讨常氧、乏氧及乏氧再氧合三种条件下60Coγ射线照射对人喉鳞癌Hep-2细胞凋亡的影响,并以p53蛋白为切入点,探讨其作用机制。以为头颈肿瘤的治疗奠定实验基础。方法:人喉鳞癌（Hep-2）细胞培养于含10%小牛血清、青霉素（l00U/ml）、链霉素（l00μg/ml）的RPMI-1640培养基中,置于37℃,5%CO2,20%O（2常氧）和/或37℃,5%CO2,2%O2,93%N2（乏氧）的培养箱,常规传代培养。待细胞进入对数生长期后,将细胞分为6组:A组（常氧组）、B组（乏氧组）、C组（乏氧再氧合组）、D组（常氧放疗组）、E组（乏氧放疗组）、F组（乏氧再氧合放疗组）。乏氧条件下培养B、C、E、F组细胞24h,之后C、F组细胞再于常氧条件下继续培养4h,D、E、F三组细胞分别接受照射剂量5Gy的60Coγ射线照射,照射后换新培养基继续培养24h,收集各组细胞。流式细胞仪检测HIF-1α（Hypoxia Inducible Factor 1 alpha, HIF-1α）、p53蛋白表达及细胞凋亡;细胞爬片免疫组化检测各组细胞HIF-1α、p53蛋白表达;RT-PCR检测各组细胞HIF-1αmRNA。结果:流式细胞检测结果显示:C组HIF-1α蛋白表达（1.36±0.08 ）明显低于B组（1.53±0.06）（P<0.05）,但同A组（1.35±0.05）相比无明显差异（P>0.05）。C、F组之间、B、E组之间及A、D组之间HIF-1α蛋白的表达量无明显差别（P>0.05）;此结果同免疫组化的显示结果相同,提示,HIF-1α蛋白在常氧情况下喉鳞癌Hep-2细胞中可有少量的表达,乏氧能明显上调Hep-2细胞中HIF-1α蛋白表达,再氧合之后增加了细胞的氧供,同乏氧组相比HIF-1α蛋白表达又呈现了下调趋势;放射线对HIF-1α蛋白的表达未产生明显的影响。p53蛋白表达同HIF-1α蛋白的表达趋势一致,流式细胞检测结果显示:C组p53蛋白的表达（1. 08±0.12 ）明显低于B组（1.24±0.07）（P<0.05）,但同A组（1.10±0.04）相比无明显差异（P>0.05）。C、F组之间、B、E组之间及A、D组之间p53蛋白的表达量无明显差别（P>0.05）;免疫组化显示了相同结果。流式和免疫组化的结果均提示,p53蛋白的表达亦受到Hep-2细胞氧供状况的影响,p53蛋白在常氧情况下喉鳞癌Hep-2细胞中有少量的表达,但乏氧能明显上调Hep-2细胞中p53蛋白表达,再氧合之后增加了细胞的氧供,同乏氧组相比p53蛋白表达又呈现了下调趋势。放射线对p53蛋白的表达未产生明显的影响。经相关分析显示,HIF-1α与p53蛋白的表达成明显的正相关,相关系数为0.9341,相关系数概率值为P=0.0064<0.01有统计学意义,说明p53蛋白的表达与HIF-1α蛋白的表达有相关性,随着HIF-1α表达的增高p53的表达也呈上调趋势。流式细胞术检测各组细胞凋亡的率,结果显示乏氧及乏氧再氧合对Hep-2细胞的凋亡率未产生明显的影响,A、B、C三组细胞的凋亡率无明显差别（P>0.05）;低氧降低60Coγ射线照射对Hep-2细胞的诱凋亡作用,D（31.68±1.27）、E（4.31±0.35）组细胞凋亡率有显著统计学意义（P<0.05）;同乏氧相比,再氧合之后其诱凋亡作用明显提高,E（4.31±0.35）、F（8.06±0.73）组细胞凋亡率有显著统计学意义（P<0.05）。RT- PCR结果显示:A（1.33±0.10）、C（1.26±0.09）组HIF-1αmRNA的表达量均明显低于B组（1.74±0.13）且P<0.05差异有统计学意义。提示低氧能增加了Hep-2细胞HIF-1αmRNA表达,同乏氧组相比再氧合之后HIF-1αmRNA表达明显降低;C、F组之间、B、E组之间及A、D组之间HIF-1αmRNA的表达量无明显差别（P>0.05）,提示放射线对HIF-1αmRNA的表达未产生明显的影响。结论: 1乏氧能明显促进HIF-1α蛋白的表达,且这一作用发生在mRNA水平;2 HIF-1α蛋白表达的增强促进了p53蛋白的表达,HIF-1α与p53蛋白的表达成明显的正相关;3 60Coγ射线对p53蛋白、HIF-1α蛋白及其mRNA的表达未产生明显的影响;4乏氧降低60Coγ射线照射对Hep-2细胞的诱凋亡作用,同乏氧条件下相比再氧合之后其诱凋亡作用明显提高。但E组（乏氧放疗组）Hep-2细胞的凋亡率降低的同时却并未出现了p53蛋白表达的降低,而同E组（乏氧放疗组）相比F组（乏氧再氧合放疗组）在Hep-2细胞凋亡率明显升高的同时也并未出现p53蛋白表达的增强。这一结果提示乏氧及乏氧再氧合之后60Coγ射线诱导Hep-2细胞凋亡作用可能是通过p53以外的其它促凋亡途径实现的。
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