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肝炎病毒检测条件的优化及藻胆蛋白相互作用研究

2020-12-03阅读(606)

肝炎病毒检测条件的优化及藻胆蛋白相互作用研究

论文摘要

病毒性肝炎是对人类健康危害严重的传染病之一。由于HBV和HCV混合感染不仅是原发性肝癌发生的原因,也是导致肝组织纤维变,加快向肝硬化发展的重要因素。所以研究HBV、HCV的病理机制为临床早期抗病毒干预治疗,控制肝组织纤维化进程,提供了理论依据,对肝癌防治具有重要意义。一般对HBV和HCV检测有免疫学方法和核酸检测法,免疫学方法主要包括放射性标记免疫分析技术、酶免技术分析（ELISA）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）和化学发光免疫分析（CLIA）等;核酸检测方法主要有斑点杂交技术和PCR技术,其中PCR技术检测存在假阳性和假阴性的情况,本实验通过优化PCR的检测条件达到快速灵敏检测,降低假阳性和假阴性的目的。本实验用已经构建好的pGEM-T-HBV（C区/C基因）和pGEM-T-HCV（核心蛋白）作为PCR检测的质粒模板,通过改变Mg2+浓度、退火温度以及采用不同的酶进行PCR检测条件的优化。其中检测HBV病毒时共设了1.5μl-4.0μl共6个Mg2+浓度梯度,设了58.0～62.0℃共12个温度梯度,质粒模板稀释浓度从10-1-10-9共9个浓度梯度。检测HCV病毒时,共设了1.5～2.0μl共6个Mg2+浓度梯度,设了56.0～60.0℃共12个温度梯度,质粒模板稀释浓度从10-1～10-9共9个浓度梯度。实验结果证明检测HBV病毒时,4.0μl为最佳Mg2+浓度,59℃为最佳退火温度,天源公司的Taq DNA聚合酶灵敏性最高,对质粒浓度的要求达到10-9。当检测HCV病毒时,1.5μl为最佳Mg2+浓度,57℃为最佳退火温度,Bio-Rad公司的iTaq聚合酶灵敏性最高,对质粒浓度的要求达到10-6。藻胆体（phycobilisome）是存在于蓝藻和红藻中的一类捕光蛋白复合物,它由藻胆蛋白（phycobiliprotein）和连接蛋白组成。藻胆蛋白由藻胆色素（phycobilin）与相应的脱辅基蛋白中保守性半胱氨酸的巯基以硫醚键共价结合而成。藻胆蛋白是一类结构相似的色素蛋白。目前已发现了一种能催化β-CPC84、β-PEC84、α-APC82和β-APC82位半胱氨酸残基与PCB连接的裂合酶基因cpeS,其编号为alr0617。为了研究PCB与层理鞭枝藻藻红蓝蛋白连接的机制β亚基（β-PEC）第84位Cys连接机制,现通过同源性分析,筛选出四个同源性较高的基因片段,即alr0617,all5339, all5292,alr0647。现根据国际标准,将编号为alr0617,all5339,all5292,alr0647基因编码的蛋白命名为CpeS1,CpeT1,CpeS2,CpeT2, CpeT1能分别与CpeT2、CpeS1、PecE形成比较明显的复合物,但是只有CpeT1与CpeT2之间形成大约1:1的复合物。本研究成功构建质粒pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、pBT- CpeT2、pBT- 3357、pTRG- CpeS1、pTRG- CpeT1、、pTRG- 3357基因。将pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、、pBT- CpeT2、pBT- 3357和pTRG- CpeT1;pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、pBT- CpeT2和pTRG- 3357;pBT- CpeS2、、pBT- CpeT2和pTRG- CpeS1共转化大肠杆菌,利用细菌双杂交系统,证明pBT- CpeT2、pBT-CpeS2、pBT-CpeS1和pBT-3357的重组子与pTRG-CpeT1的重组子有相互作用,pBT-CpeS2和pBT-CpeS1与pTRG-3357的重组子的蛋白质间有相互作用,而pBT-CpeS2和pTRG-CpeS1间没有相互作用。

论文目录

  • 第一部分内容： PCR 检测HBV 和HCV 条件优化的研究
  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 1.1 肝炎病毒的研究概况
  • 1.1.1 乙肝的研究概况
  • 1.1.2 丙肝的研究概况
  • 1.2 肝炎病毒的结构特征
  • 1.2.1 乙肝的结构特征
  • 1.2.2 丙肝的结构特征
  • 1.3 肝炎病毒的发病机制
  • 1.3.1 乙型肝炎的发病机制
  • 1.3.2 丙型肝炎的发病机制
  • 1.4 肝炎病毒的临床特征
  • 1.4.1 乙型肝炎病毒的临床特征
  • 1.4.2 丙型肝炎的临床特征
  • 1.5 病毒性肝炎的诊断方法
  • 1.5.1 乙肝病毒的诊断方法
  • 1.5.2 丙肝病毒的诊断方法
  • 1.6 本课题研究的意义
  • 第二章 乙肝病毒前C区基因的转化与PCR 检测乙肝病毒条件的优化
  • 2.1 引言
  • 2.1.1 研究乙肝病毒前C 区基因的转化的方法和目的
  • 2.1.2 PCR 检测乙肝病毒条件的优化
  • 2.2 材料和方法
  • 2.2.1 材料和仪器
  • 2.2.2 方法
  • 2.3 结果和分析
  • 2.3.1 DNA 电泳图谱的分析
  • 2.3.2 PCR 电泳图谱的分析
  • 2.4 结论
  • 第三章：HCV核心区基因的转化与PCR条件的优化
  • 3.1 引言
  • 3.1.1 研究丙肝病毒核心区基因的转化的方法和目的
  • 3.1.2 PCR 检测丙肝病毒条件的优化
  • 3.2 材料和方法
  • 3.2.1 材料和仪器
  • 3.2.2 方法
  • 3.3 结果和分析
  • 3.3.1 DNA 电泳图谱的分析
  • 3.3.2 质粒酶切图谱
  • 3.3.3 PCR 电泳图谱的分析
  • 3.4 结论
  • 第四章 总结
  • 参考文献
  • 第二部分内容 鱼腥藻PCC7120 藻胆体alr3357 分子生物学研究
  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 1.1 蓝藻与藻胆体
  • 1.2 藻胆蛋白
  • 1.3 藻胆蛋白的研究进展
  • 1.4 细菌双杂交系统
  • 1.5 研究意义
  • 第二章 克隆
  • 2.1 集胞藻PCC6803 ApcE 缺失体基因片段的克隆
  • 2.1.1 引言
  • 2.1.2 材料与方法
  • 2.1.3 结果和分析
  • 2.1.4 讨论
  • 2.2 集胞藻PCC6803 apcE（Arm2）基因片段的克隆
  • 2.2.1 引言
  • 2.2.2 材料与方法
  • 2.2.3 结果和分析
  • 2.2.4 讨论
  • 2.3 PCC7421 all1531 基因片段的克隆
  • 2.3.1 引言
  • 2.3.2 材料与方法
  • 2.3.3 结果和分析
  • 2.3.4 讨论
  • 2.4 鱼腥藻PCC7120 CpeT1、CpeT2、CpeS1、CpeS2 基因片段的克隆
  • 2.4.1 引言
  • 2.4.2 材料与方法
  • 2.4.3 结果和分析
  • 2.4.4 讨论
  • 2.5 鱼腥藻PCC7120 alr3357 基因的克隆
  • 2.5.1 引言
  • 2.5.2 材料与方法
  • 2.5.3 结果和分析
  • 2.5.4 讨论
  • 第三章 眉藻PCC7601 CpeB基因48、59 位半胱氨酸突变体的克隆
  • 3.1 引言
  • 3.1.1 研究眉藻PCC 7601CpeB 基因定点突变的方法和目的
  • 3.1.2 眉藻PCC 7601CpeB 基因定点突变的克隆
  • 3.1.3 眉藻PCC 7601CpeB 基因定点突变的序列分析
  • 3.2 实验材料和方法
  • 3.2.1 材料和试剂
  • 3.2.2 方法
  • 3.3 结果和分析
  • 3.3.1 二级结构分析
  • 3.3.2 DNA 电泳及测序结果分析
  • 3.4 讨论
  • 第四章 鱼腥藻PCC7120 CpeS1、CpeS2、CpeT1、CpeT2和alr3357蛋白质间相互作用的研究
  • 4.1 引言
  • 4.1.1 研究鱼腥藻PCC7120 CpeS1、CpeS2、CpeT1、CpeT2 和alr3357 蛋白质间相互作用的方法和目的
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 材料与仪器
  • 4.2.2 方法[45]
  • 4.3 结果和分析
  • 4.4 讨论
  • 第五章 总结
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录1 缩略词（Abbreviation）

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